邵盈盈，李向榮

(1.浙江大學(xué)藥學(xué)院，浙江杭州 310058;2.浙江大學(xué)城市學(xué)院，浙江杭州 310015)

藍莓，又稱越橘，屬杜鵑花科，越橘屬植物，為多年生落葉或常綠灌木，是地球上少有的真正的藍色食物之一［1］。果實富含花青素，綠原酸，黃酮等多種生物活性成分，而其中的黃酮類化合物在抗氧化、保護人體免受自由基的損傷，增強血管彈性，改善循環(huán)系統(tǒng)，增強免疫力，延緩衰老，保護視力，改善弱視等方面起到一定的作用［2－4］。因此藍莓是理想的天然抗氧化產(chǎn)物的來源。大孔吸附樹脂是一種有機高聚物吸附劑，具有性質(zhì)穩(wěn)定、選擇性強、處理量大、再生方便等優(yōu)點，在天然產(chǎn)物工業(yè)化提取分離中有廣泛的應(yīng)用［5］。目前對藍莓果渣、藍莓葉中花青素和黃酮的純化及其抗氧化活性研究較多［6］，而對藍莓果實中總黃酮的分離純化和抗氧化活性少見報道，因此，本實驗對4種樹脂進行篩選，考察了各工藝對純化效果的影響，確定最優(yōu)純化條件，初步探討了藍莓總黃酮的抗氧化活性，為藍莓在食品、藥品領(lǐng)域的進一步開發(fā)和綜合利用提供了實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蘆丁標準品 中國藥品生物制品檢定所，批號:100080－200707;藍莓 智利進口，品種:藍豐藍莓;AB－8、NKA－9、NKA－Ⅱ、D101 型大孔吸附樹脂 南開大學(xué)化工廠;VC對照品 桐鄉(xiāng)市康普達生物科技有限公司，批號:20110630;DPPH 美國Sigma公司;鄰二氮菲 天津市大茂化學(xué)試劑廠生產(chǎn);其他試劑均為分析純。

Mettler Toledo AL104電子天平 梅特勒－托利多儀器上海有限公司;KQ－700DB型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;TU－1901型雙光束紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 RE－2000B型 上海亞榮生化儀器廠;DKZ－1型電熱恒溫振蕩水槽 上海精宏實驗設(shè)備有限公司;粉碎機FW135 天津市泰斯特儀器有限公司;DHG－9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司;SHB－ⅢA型循環(huán)水式多用真空泵 河南省太康科教器材廠;HH－4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司;φ2cm×40cm層析柱 常青化工。

1.2 標準曲線的制備［7］

精密稱取蘆丁標準品40.0mg，置于100mL容量瓶中，用60%乙醇溶解并定容，配成0.4mg·mL－1的標準品儲備液。分別吸取儲備液0、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、2.8、3.2mL 至 10mL 刻度試管中，加 30%乙醇至5.4mL，搖勻，加5%NaNO2溶液0.3mL，搖勻靜置6min，加10%Al(NO3)3溶液0.3mL，搖勻靜置6min，加4%NaOH溶液4mL，搖勻靜置15min后在510nm處測定吸光度(以試劑空白做參比)，建立回歸方程為A=13.693C－0.0103(R2=0.9994)。

1.3 藍莓總黃酮的提取及含量測定

1.3.1 藍莓預(yù)處理 藍莓鮮果洗凈自然晾干后，放入干燥箱內(nèi)40℃下干燥1d，取出剪開后繼續(xù)干燥至恒重。將干燥藍莓粉碎成細顆粒狀，過24目篩，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 藍莓總黃酮的提取 取預(yù)處理藍莓粉末50g，用20倍量50%乙醇于40℃超聲提取三次，每次45min，固定超聲功率560W，超聲提取后抽濾，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后備用。

1.3.3 樣品溶液黃酮含量的測定 取樣品溶液1mL，置于10mL刻度試管中，自“加30%乙醇至5.4mL”起，按標準曲線測定方法操作，測定吸光度，計算樣品溶液的濃度及黃酮含量。

1.4 大孔樹脂純化藍莓總黃酮

1.4.1 大孔樹脂預(yù)處理 用體積分數(shù)95%的乙醇浸泡24h，而后用95%乙醇洗至取出適量流出液加水混合不出現(xiàn)渾濁為止，在乙醇中儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 樹脂靜態(tài)篩選 分別取一定體積(相當于1g干樹脂)的四種樹脂置100mL具塞錐形瓶中，加提取液30mL，25℃水浴振蕩24h，使其達到飽和吸附，靜置2h過濾，吸取濾液測定總黃酮濃度。按式(1)計算樹脂飽和吸附量:

過濾出來的樹脂吸干表面水分，加入體積分數(shù)50%的乙醇30mL，25℃水浴振蕩6h，靜置2h過濾，測定濾液濃度，按式(2)計算洗脫率:

1.4.3 純化藍莓總黃酮單因素考察 上樣濃度對黃酮回收率的影響:將不同濃度的藍莓總黃酮提取液動態(tài)上樣，用3BV的60%乙醇溶液(調(diào)pH3)洗脫，洗脫流速為2mL·min－1。洗脫液pH對黃酮回收率的影響:將一定濃度的藍莓總黃酮提取液動態(tài)上樣，用3BV的pH分別為1、2、3、4、5的60%乙醇溶液洗脫，洗脫流速為2mL·min－1。洗脫液濃度對黃酮回收率的影響:將一定濃度的藍莓總黃酮提取液動態(tài)上樣，用3BV濃度分別為40%、50%、60%、70%、80%的固定 pH3的乙醇溶液洗脫，洗脫流速為2mL·min－1。洗脫流速對黃酮回收率的影響:將一定濃度的藍莓總黃酮提取液動態(tài)上樣，用3BV的60%乙醇溶液(調(diào)pH3)洗脫，洗脫流速分別控制在0.5、1、2、3、4mL·min－1。四個單因素實驗中上樣流速均固定為2mL·min－1，上樣完成后靜置1h，洗脫前用3BV純化水對樹脂柱進行沖洗，洗脫過程中收集洗脫液，計算回收率。

1.4.4 純化藍莓總黃酮的正交實驗 以25mL床層體積(BV)的樹脂裝柱，用大量蒸餾水沖洗樹脂至流出液無醇味為止。根據(jù)單因素實驗結(jié)果，確定因素水平表，按各正交實驗號下條件進行上樣，見表1，上樣流速固定2mL·min－1，上樣完成后靜置1h使黃酮類成分能夠大量吸附，洗脫前用3BV純化水對樹脂柱進行沖洗，然后用3BV的相應(yīng)洗脫液洗脫，收集洗脫液，計算回收率。

表1 因素水平表Table1 Factors and levels

1.4.5 藍莓總黃酮純度的測定 按最佳條件純化后的藍莓總黃酮洗脫液55℃真空干燥后稱重、測定其中總黃酮的含量，計算純度。

1.5 藍莓總黃酮抗氧化活性測定

1.5.1 對 DPPH自由基的清除能力［7］精密稱取19.716mg DPPH，用無水乙醇溶解定容于250mL容量瓶中，得C=0.2mmol·L－1的溶液。將純化后的藍莓總黃酮、蘆丁標準品和VC分別用無水乙醇配置成各個濃度，在10mL比色管中加入待測樣液2mL，DPPH·溶液2mL，混勻，避光靜置30min，在517nm處測定吸光度A樣品，以2mL無水乙醇代替待測液，得到吸光度A空白，以2mL無水乙醇代替DPPH·溶液，得到吸光度A對照。每一吸光度平行測定三次，取平均值。清除率按式(3)計算:

1.5.2 對羥基自由基(·OH)的清除能力［8］在比色管中加入1.5mmol·L－1鄰二氮菲的無水乙醇溶液1mL，PBS 溶液 2mL 和 1.5mmol·L－1FeSO4溶液1mL，混勻后，再加入各濃度樣液1mL和0.1%H2O2溶液1mL，充分混勻后，37℃水浴60min，在536nm處測定樣品吸光度A樣品。以蒸餾水2mL代替樣液和H2O2溶液所測吸光度為空白吸光度A空白，以蒸餾水1mL代替樣液所測吸光度為損傷吸光度A損傷。清除率按式(4)計算:

2 結(jié)果與分析

2.1 四種樹脂的靜態(tài)吸附與解析實驗結(jié)果

由表2可知，NKA－Ⅱ型樹脂的飽和吸附量最高，NKA－9和AB－8型次之，D101型樹脂的吸附量最小，從解析率來看，也是NKA－Ⅱ型樹脂最容易解析，其次分別是 NKA－9、D101、AB－8。因此選擇NKA－Ⅱ型樹脂作為純化藍莓總黃酮的樹脂。

表2 四種樹脂的靜態(tài)吸附－解析結(jié)果Table2 Static adsorption capacity and elution ratio result of four types of macroporous resins

2.2 單因素考察實驗結(jié)果

分析表3～表6可知，隨著上樣液濃度的增大，黃酮回收率增加，當濃度為1.355mg·mL－1時，回收率達到最大，之后濃度增加，黃酮回收率呈下降趨勢。當洗脫液pH為3時總黃酮的回收率最高。乙醇濃度較低時，回收率隨著濃度上升而增加，到達60%時最高，隨后略有下降。流速較慢時，回收率變化不大，增加流速，回收率逐漸降低。

表3 上樣濃度對黃酮回收率的影響Table3 Effect of concentration of liquid sample on recovery yield of total flavonoids

表4 洗脫液pH對黃酮回收率的影響Table4 Effect of eluent’s pH on recovery yield of total flavonoids

表5 洗脫液濃度對黃酮回收率的影響Table5 Effect of concentration of ethanol on recovery yield of total flavonoids

表6 洗脫流速對黃酮回收率的影響Table6 Effect of elution velocity on recovery yield of total flavonoids

2.3 NKA－Ⅱ型樹脂純化藍莓總黃酮正交實驗結(jié)果

分析表7可得:B為主要因素，C和A次之，D最小，最佳工藝條件為A2B2C3D2，因此確定純化藍莓總黃酮的最佳工藝條件為上樣濃度1.355 mg·mL－1，洗脫 pH為 3，洗脫乙醇濃度 70%，洗脫流速2mL·min－1。在該條件下重復(fù)實驗兩次，回收率為96.83%，均高于正交實驗時的回收率。將最佳工藝條件下純化后的洗脫液真空干燥，計算純度得41.41%，比未純化前提高33.94倍。

2.4 藍莓總黃酮抗氧化活性測定結(jié)果

2.4.1 DPPH自由基清除能力 DPPH·是一種穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，其乙醇溶液呈深紫色，在517nm處有一強吸收。當有自由基清除劑存在時，其供氫或供質(zhì)子特性，可以與DPPH·的單電子配對，使自由基濃度降低，紫色減弱。褪色程度與DPPH·接受的電子數(shù)量成定量關(guān)系，反應(yīng)快速、靈敏、簡便，因此可用于評價天然產(chǎn)物的自由基清除活性。由表8可知，蘆丁、藍莓總黃酮和VC對DPPH·的清除能力表現(xiàn)為隨著濃度的升高，清除率迅速上升，而且基本呈線性關(guān)系，藍莓總黃酮和蘆丁的清除能力相當，但弱于VC。

表8 藍莓總黃酮、蘆丁和VC對DPPH·清除能力Table8 Scavenging activity of flavonoids from blueberry lutin and VCon DPPH·

2.4.2 羥基自由基(·OH)清除能力 Fe2+與H2O2反應(yīng)生成·OH，F(xiàn)e2+與鄰二氮菲反應(yīng)生成紅色配合物，·OH能氧化Fe2+成為Fe3+而使紅色配合物減少，當有抗氧化劑存在時，抗氧化劑與·OH作用減弱了·OH對Fe2+的氧化，而使吸光度有所變化，因此常用來檢測天然化合物的抗氧化活性。蘆丁、藍莓總黃酮和VC對·OH的清除率也是隨著濃度的升高而迅速上升，基本呈線性關(guān)系，藍莓總黃酮清除·OH的能力最強，高于蘆丁和VC，見表9，因此可知藍莓總黃酮具有較好的清除·OH的能力。

表9 藍莓總黃酮、蘆丁和VC對·OH清除能力Table9 Scavenging activity of flavonoids from blueberry lutin and VCon·OH

3 結(jié)論與討論

本實驗通過對四種樹脂進行篩選，得出NKA－Ⅱ型樹脂對藍莓總黃酮有較好的吸附和解吸性能，富集效果好，因此選用NKA－Ⅱ樹脂進行純化正交實驗。最佳純化工藝為:上樣濃度1.355 mg·mL－1，洗脫pH為 3，洗脫乙醇濃度 70%，洗脫流速2mL·min－1。其中洗脫液pH對純化的影響最大，在pH為3時的效果最好，因為黃酮類物質(zhì)為多羥基化合物，呈現(xiàn)一定的酸性，所以在微酸性條件下容易被樹脂吸附，而且藍莓總黃酮中花青苷類所占比例較大，花青苷類物質(zhì)在pH等于3時最穩(wěn)定。大孔樹脂純化有效成分是利用其對有效成分吸附－解析的可逆性，因此洗脫劑濃度亦是純化過程中的重要影響因素，本實驗得出洗脫劑乙醇的濃度為70%時純化效果較好，與50%和60%的乙醇相比，更易將藍莓總黃酮從大孔樹脂上解析下來。

實驗中，上樣時采用的流速是2mL·min－1，因為大孔吸附樹脂的柱層析是一種動態(tài)吸附過程，溶液上樣流速的變化直接影響黃酮分子向樹脂內(nèi)表面的擴散，從而影響吸附效率，流速過快，樹脂對總黃酮吸附不充分，易造成浪費，但流速過慢，將導(dǎo)致整個生產(chǎn)周期的延長。上樣完成后靜置1h使黃酮類成分能夠充分吸附，在洗脫前，用3BV的純化水先對樹脂柱進行沖洗，以除去大部分糖類和氨基酸等雜質(zhì)，保證醇洗脫時流出液具有最大的純度。藍莓總黃酮提取液經(jīng)大孔吸附樹脂處理后純度增加，雜質(zhì)大幅度降低，同時樹脂處理可有效地除去提取液中的糖類、無機鹽、蛋白質(zhì)等。此純化方法操作簡便，回收率高，對于工業(yè)化生產(chǎn)有一定的參考意義。

本文還采用DPPH法和鄰二氮菲法評價了藍莓總黃酮的抗氧化活性，通過對藍莓總黃酮、蘆丁和VC的對照實驗表明，藍莓總黃酮可有效清除DPPH·和·OH，其中對·OH的清除能力優(yōu)于天然抗氧化劑VC，推測黃酮類化合物中的多元酚羥基是其具有抗氧化活性的主要藥效基團?？傊{莓中的黃酮類化合物是一種良好的自由基清除劑，可作為一種新的提取天然食品抗氧化劑的水果加以開發(fā)利用，具有廣闊的市場前景。

［1］胡雅馨，李京，惠伯棣.藍莓果實中主要營養(yǎng)及花青素成分的研究［J］.食品科學(xué)，2006，27(10):600－603.

［2］Pietta P G.Flavonoids as antioxidants［J］.J Nat Prod，2000，63:1035－1042.

［3］陳介甫，李亞東，徐哲.藍莓的主要化學(xué)成分及生物活性［J］.藥學(xué)學(xué)報，2010，45(4):422－429.

［4］Cho M J，Howard L R，Prior R L，et al.Flavonoid glycosides and antioxidant capacity of various blackberry，blueberry and red grape genotypes determined by high－performance liquid chromatography/mass spectrometry［J］.Journal of the Science of Food and Agriculture，2004，84:1771－1782.

［5］姚玉翠，李向榮.大孔吸附樹脂分離純化玫瑰花中原花青素的研究［J］.中藥材，2008，31(8):1239－1241.

［6］李穎暢，孟憲軍.藍莓葉黃酮提取物抗氧化活性的研究［J］.營養(yǎng)學(xué)報，2008，30(4):427－429.

［7］高麗威，李向榮.微波萃取法提取紫心甘薯總黃酮及其抗氧化活性研究［J］.浙江大學(xué)學(xué)報:理學(xué)版，2009，36(5):571－574.

［8］金鳴，蔡亞榮，李金榮，等.鄰二氮菲－Fe2+氧化法檢測H2O2/Fe2+產(chǎn)生的羥自由基［J］.生物化學(xué)與生物物理進展，1996，23(6):553－555.