耿亞男，曹 棟，聶新艷，楊貝貝

(江南大學食品學院，江蘇無錫 214122)

脂質體是一類由脂質發(fā)生自我凝聚時產(chǎn)生的微囊體。近些年來，脂質體在食品、化妝品、醫(yī)藥中都有廣泛應用［1］，如抗癌藥物的靶向給藥，包埋激素類肽、抗生素、維生素、酶等，脂質體已經(jīng)成為一種理想的藥物傳遞載體。脂質體的主要膜材為磷脂，磷脂是一種常見的有機兩性分子，由于其脂肪酸不飽和程度較高，極易發(fā)生氧化。在實際生產(chǎn)過程中，脂質體的放大性生產(chǎn)及其保存是阻礙其應用的最大難題。影響脂質體保存的主要原因是其具有易氧化、變形、分解等不穩(wěn)定的缺點，其中，磷脂的氧化是影響脂質體品質的最大因素。氧化后的磷脂必然導致膜結構發(fā)生改變，會影響雙層膜的流動性，使其發(fā)生相分離［2－3］，并使囊泡內(nèi)部無序化，形成孔洞［4－5］，從而破壞脂質體。究其氧化原因，主要是由于活性氧攻擊脂質體膜，氧化后的磷脂雙鍵被破壞而形成各種不同的小分子［6］。目前，磷脂氧化對脂質體膜的影響機制還不明朗，本實驗通過Fenton反應控制脂質體氧化，并通過脂質體的粒徑、Zeta電位、脂質體膜的微極性、流動性及形態(tài)等，研究了氧化對脂質體膜的破壞作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆磷脂酰膽堿 SPC90，江蘇曼氏生物科技有限公司;1，6－二苯基－1，3，5－己三烯 DPH Sigma公司;鈣黃綠素 上海邁坤化工有限公司;Sephadex G－25 北京瑞達恒輝科技發(fā)展公司;氯仿、甲醇、氯化亞鐵、過氧化氫、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、硫代巴比妥酸、三氯乙酸、濃鹽酸 國藥集團化學試劑有限公司;所用試劑均為分析純。

UV－260紫外分光光度計 日本島津;納米粒度及ZETA電位儀 英國馬爾文公司;F－7000熒光光譜儀;H－7650透射電子顯微鏡 日本Hitachi公司;Hettich EBA20小型離心機 萊比信科技發(fā)展有限公司;電子精密天平 上海梅特勒－托利多儀器有限公司;旋轉蒸發(fā)儀 南京予凱儀器設備有限公司;超聲波發(fā)生器 無錫科潔超聲電子設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 脂質體制備 取0.02g大豆卵磷脂置于小燒杯中，加入3mL氯仿/甲醇(2/1，V/V)混合液，放入1.0g左右玻璃珠，晃動溶解。將混合液轉移到500mL燒瓶中，于45℃、40r/min水浴蒸發(fā)氯仿/甲醇混合有機溶劑。在瓶內(nèi)壁形成一層薄膜，持續(xù)真空旋蒸1h以除去殘余溶劑，結束后沖入保護氣體氮氣。加入5mL磷酸鹽緩沖液(10mmol/L，pH7.4)水化脂質薄膜，形成5mL粗脂質乳狀液。暗處用磁力攪拌器攪拌10min，所得粗脂質體超聲(200W)處理10min，使用0.22μm濾膜過濾兩次整粒，暗處放置1h進行下步操作。

1.2.2 MDA值的測定 磷脂氧化后產(chǎn)物MDA的測量根據(jù)文獻［7］并稍有修改。TBA溶液配制:TCA 30g，TBA 0.75g，0.25mol/L 鹽酸 200mL，溫熱溶解，過濾后得TCA－TBA－HCl溶液。量取脂質體乳狀液1.0mL于10mL帶刻度試管中，加入TCA－TBA－HCl混合溶液5mL，混勻，于100℃水浴30min，立刻冷卻。使用 TCA－TBA－HCl溶液定容至10mL，5000r/min離心 10min，以 TCA－TBA－HCl溶液為空白，測定532nm處溶液的吸光值(MDA的摩爾吸光率為1.56×105L/mol·cm)。剛制備好的脂質體即用TBA的方法測量其在制備過程中的氧化程度。

1.2.3 透射電鏡觀察脂質體形態(tài) 參照Mohsen M等［8］磷鎢酸－負染色法預處理脂質體乳狀液，將體系中磷脂酰膽堿的濃度稀釋至為10mg/mL，先用潔凈干燥的注射器吸取剛制備好的脂質體滴至附有支持膜的銅網(wǎng)上，樣品在Formvar膜上吸附約10min后，用濾紙小心吸除多余液體，再向膜上滴加2%磷鎢酸，染色5min左右，濾紙吸去染液，用燈烘干。在Hitachi透射電鏡(H－7650)下觀測并調(diào)整適合放大倍數(shù)進行拍照。

1.2.4 脂質體膜的微極性測定 制備10－4mol/mL的芘的甲醇溶液，取0.5mL芘溶液于三角瓶中，氮氣吹干，加入40mL所制備的粗脂質體乳狀液，控制溫度40℃超聲(200W)1h，測量芘的第一發(fā)射峰與第三發(fā)射峰強度比值I1/I3(在372nm處熒光強度與在384nm處的比值)以表征脂質體膜的微極性。

1.2.5 脂質體包封率測定 將適量鈣黃綠素溶于磷酸鹽緩沖液中，用上述緩沖液制備脂質體。取1mL脂質體樣品，置于用PBS平衡過的sephadex G－25柱上端，以PBS為洗脫液，于206nm處監(jiān)測脂質體流出時間，使用熒光分光光度計測量熒光強度(EM 490nm，EX 520nm)，收集脂質體。將流出的脂質體溶液置于25mL容量瓶中，PBS加至刻度，混勻。測定分離前后脂質體的熒光強度(F)，分別計算兩種脂質體的包封率，按公式(1)計算。

式中，E(%)包封率;K－樣品的稀釋倍數(shù)比，本實驗為K取25;FL－所分離脂質體的熒光值;FT－原脂質體總熒光強度［9］。

1.2.6 脂質體的膜流動性測定 使用1，6－二苯基－1，3，5－己三烯(DPH)對囊泡雙層流動性進行評估，測定雙層膜的熒光偏振率。DPH儲備液添加至脂質體溶液中，達到最終磷脂與DPH濃度(molar)比為500∶1。混合液進行超聲(200W)并且45℃水浴保持1h。使用熒光光譜儀(F－7000)測量熒光光譜，設定發(fā)射光波長為426nm，激發(fā)光波長為348nm，發(fā)射光狹縫寬度10nm，激發(fā)光狹縫寬度為5nm。熒光偏振率按式(2)、式(3)計算。

式中，對公式中的字母含義做解釋;計算出相對偏振度Pn/P0［10］，P0為所測偏振度幾個之中的最小值(即氧化24h時所測值)，Pn為除最小值之外的其他值。計算的偏振率越大，膜的流動性越小，兩者成反比。

2 結果與討論

2.1 脂質體MDA值的變化

圖1為未添加Fenton試劑和添加Fenton試劑后24h內(nèi)脂質體MDA值的變化。

圖1 Fenton試劑對脂質體氧化的影響Fig.1 Influence of oxidation on MDA of liposomes

分析圖1可知，與未添加Fenton試劑的脂質體相比，添加Fenton試劑后脂質體的氧化程度明顯增加，并且在24h內(nèi)，氧化已經(jīng)達到一定程度。因此，可以確定添加Fenton試劑能夠迅速引發(fā)脂質體氧化，并且通過重復實驗可知，脂質體的氧化程度可以通過控制其反應時間來控制。

2.2 脂質體粒徑及Zeta電位的變化

脂質體溶液適度稀釋后測量其粒徑。用納米粒度及Zeta電位儀測其粒徑分布，結果見表1和圖2。

表1 脂質體氧化后粒徑及Zeta電位的變化Table1 The influence of oxidation on particle size and Zeta potential

由圖2可以看出，在未加入Fenton試劑時，脂質體粒徑分布為正態(tài)分布，且分布比較集中。添加Fenton試劑的脂質體與未添加Fenton試劑的脂質體相比，在24h后，脂質體的粒徑略微變大，PDI指數(shù)也有所增加，這可能是脂質體氧化后膜之間發(fā)生融合而造成的。未添加Fenton試劑的脂質體粒徑與其24h前相比，粒徑稍有減小，這是剛制備好的脂質體在抽濾整粒后多聚集在一起，隨后放置過程中發(fā)生少量分離的原因。表1結果顯示，脂質體在氧化過程中，其粒徑變化趨勢為先增大再變小。氧化72h內(nèi)，脂質體大小并發(fā)生較明顯變化，但96h時，脂質體的粒徑及分布均發(fā)生劇烈改變，此時的脂質體膜可能由于氧化發(fā)生崩解，脂質體變成膜的碎片，導致平均粒徑變小，且大小不一。

圖2 脂質體氧化后粒徑的變化Fig.2 The changes of liposome size after oxidation

脂質體膜表面電荷對脂質體的物理化學穩(wěn)定性也具有重要意義［11］，如改善脂質體降解，及降低磷脂氧化率。添加Fenton試劑后用納米粒度及Zeta電位儀測脂質體膜表面電位，由表1可以看出，F(xiàn)enton試劑加入后，Zeta電位的絕對值減小。一般來說，脂質體膜電位絕對值越大，由于膜之間的斥力作用，體系越加穩(wěn)定。由文獻［12］可知，實驗原料中還有少量電負性磷脂，因此，Zeta電位的降低一方面可能是由于電負性磷脂氧化導致含量降低，另一方面可能是氧化所產(chǎn)生的氧化產(chǎn)物而造成的。另外，Zeta電位絕對值的降低使得體系更加不穩(wěn)定。

2.3 電鏡掃描脂質體形態(tài)的變化

由圖3分析可知，所制備的脂質體大小較為均勻，大小基本保持在110～130nm，與納米粒度儀所測結果是一致的。未氧化的脂質體的形態(tài)相對較為規(guī)則，大小較集中，邊界較清晰，所制得脂質體多為多室脂質體;經(jīng)Fenton試劑氧化24h后，脂質體形態(tài)上與前者出現(xiàn)較大不同，脂質體的粒徑接近200nm，并且大小不均，形態(tài)不規(guī)則，脂質體邊界不整齊，處于瓦解邊緣。脂質體溶液中出現(xiàn)了脂質體碎片，另外，原來的多室消失，出現(xiàn)了融合的現(xiàn)象。融合是導致脂質體粒徑變大的最主要原因。在脂質體氧化96h時，脂質體已經(jīng)不是球形，脂質體基本完全瓦解崩潰，溶液中出現(xiàn)的是大量的脂質體膜碎片。

2.4 脂質體膜的微極性的變化

計算各膠束體系的I1/I3，根據(jù)它隨時間的變化繪制得到圖4。

根據(jù)芘的熒光強度I1/I3值大小可以確定脂質體膜體系的微極性。由于芘元素非極性大，其主要分布在磷脂分子的非極性尾中，即雙層膜之間。I1/I3值反映芘周圍環(huán)境的變化，比值越大，微極性越強，探針所處的環(huán)境非極性越弱;比值越小則微極性越弱，探針所處的環(huán)境非極性越強。由圖4可以看出，隨著氧化時間的增加，脂質體膜的微極性大體上略有增加。這是由于磷脂在氧化過程中產(chǎn)生的氧化產(chǎn)物主要是極性小分子，氧化后的磷脂極性增加的趨勢，與所預測的是一致的。

圖3 脂質體氧化后其形態(tài)變化Fig.3 Microscopic image of liposome

圖4 脂質體膜微極性的變化Fig.4 The influence of oxidation on liposome micropolaity

2.5 脂質體包封率的變化

測定添加Fenton試劑前后所分離的脂質體熒光強度的變化，進而得到包封率變化。

表2 脂質體包封率的變化Table2 The influence of oxidation on liposomes encapsulation

包埋率可以驗證脂質體膜的完整性，鈣黃綠素為水溶性物質，因此，鈣黃綠素的包埋率越高，膜的結構越致密，膜的完整性程度越高。實驗結果表明，脂質體在添加Fenton試劑后，鈣黃綠素包封率降低了一倍。磷脂脂肪酸鏈氧化后發(fā)生斷裂或基團改變，引起了脂質體膜的降解及融合，使鈣黃綠素從脂質體中溶出，從而影響了膜的致密性。將包埋有鈣黃綠素的脂質體溶液置于透析袋中，每20h檢測一次透析液鈣黃綠素熒光強度，結果如圖5所示，在加入Fenton試劑50h內(nèi)，鈣黃綠素的泄漏量持續(xù)增加;而50h后，透析液中的鈣黃綠素含量逐漸下降。實驗證實，在氧化初期，脂質體膜發(fā)生破裂融合，鈣黃綠素在膜降解過程中釋放出來，在4d后，脂質體在氧化的作用下基本上全體瓦解，鈣黃綠素完全釋放出來。

圖5 脂質體泄漏率與其氧化時間之關系Fig.5 The relationship between liposome leakage rate and its oxidation time

2.6 脂質體膜的流動性變化

由圖6可以看出，經(jīng)Fenton試劑氧化后，膜的相對流動性下降，膜的流動性主要是依靠脂肪酸的相對運動，氧化后脂肪酸鏈發(fā)生斷裂，降解是膜的流動性降低的主要原因。脂質體在添加Fenton試劑后其膜流動性下降，可能是由于氧化后磷脂發(fā)生改性，磷脂脂肪酸鏈可活動自由度降低。

圖6 脂質體膜流動性的變化Fig.6 The influence of oxidation on the liposomal membrane relative mobility

3 結論

本實驗通過一些較新的實驗手段對氧化后的脂質體膜進行的分析。通過對照Fenton反應控制氧化前后脂質體性質的變化，包括MDA值、粒徑、Zeta、形態(tài)、膜微極性、包埋率和膜流動性，進而確定了氧化對脂質體性質的影響。隨著氧化的深入，脂質體的粒徑分布更加不集中，由于多室脂質體膜融合，其體積稍有變大，脂質體的形態(tài)也不規(guī)則，最后脂質體發(fā)生了降解，脂質體溶液中出現(xiàn)了脂質體碎片。由于氧化過程中產(chǎn)生的極性小分子，脂質體膜的微極性大體上略有增加。氧化后脂質體包埋率下降，在4d后脂質體所包埋的鈣黃綠素基本上釋放完全。由于氧化后脂肪酸鏈發(fā)生斷裂，膜的相對流動性下降。

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