何平

肢體缺血-再灌注(LIR)不僅可以造成缺血組織嚴重損傷，而且可致心肌損傷。本試驗觀察LIR所致心肌損傷的影響，并探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料 標本:健康雄性Wistar大鼠，體重210～260 g，由本院動物中心提供。自由進食、飲水，自然光照，室溫(25.2±2.0)℃，分籠常規(guī)喂養(yǎng)。

1.2 試劑 丙二醛(MDA)試劑盒，黃嘌呤氧化酶活力(XOD)試劑盒，超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(南京建成生物制品公司)。

1.3 方法

1.3.1 動物分組 動物隨機分為2組，每組10只。①IR組:按模型操作。②對照組(Control組):橡皮帶松弛環(huán)繞肢體，不阻斷血流，其余操作同IR組。

1.3.2 模型制備及標本采集:Wistar大鼠試驗開始前需禁食12 h，允許自由飲水。采用我科室常規(guī)方法［1］復制大鼠LIR模型:經乙醚淺麻醉下，用適度松緊的橡皮帶環(huán)繞結扎大鼠雙后肢根部以阻斷血流4 h，松解橡皮帶再恢復血流灌注2 h。各組動物在再灌注2 h時穿刺腹主動脈取血并提取組織標本，血液經3 500 r/min離心15 min，所得血漿標本分裝在干凈的Eppendorf管中，－70℃保存?zhèn)溆谩Ｍ瑫r立即開胸取出心臟，迅速縱向剖開左心室，冷磷酸鹽緩沖液(PBS)充分沖洗，用濾紙吸干表面水分，液氮速凍，－70℃儲藏備用。此外，每組隨機取5份新鮮心臟標本，于心尖部位橫斷面切取組織塊(長約0.5 cm)迅速投入10%甲醛溶液中固定，次日更換固定液，石蠟包埋后備用。

1.3.3 觀測指標

1.3.3.1 10%心肌組織勻漿的制備:應用扭力天平稱取已凍存的心肌組織200 mg，在蠟板上用眼科剪將其細細剪碎，移入裝有2 ml冷0.9%氯化鈉溶液的勻漿管中，冰浴條件下電動勻漿3 min。勻漿液經3 500 r/min離心15 min后，收集上清液，測定所需要的心肌組織各項生化指標。

1.3.3.2 心肌組織MDA的測定:①測定原理:MDA是過氧化脂質降解的產物，它可與硫代巴比妥酸(TBA)縮合形成一種紅色物質，此物質在532 nm處有最大吸收峰，通過對此物質的測定，可推算出MDA的含量。②測定方法:旋渦混勻器混勻，試管口用保鮮薄膜扎緊并用針頭刺一小孔，95℃水浴(或用鍋開蓋煮沸)40 min，取出后流水冷卻，然后3 500～4 000 r/min，離心10 min。用移液器吸取上清，532 nm處、1 cm光徑、蒸餾水調零測各管吸光度值。見表1。③計算公式:組織MDA(nmol/mgprot)=×標準品濃度(10nmol/ml)÷組織中蛋白含量(mgprot/ml)。見表1。

表1 心肌組織MDA測定方法

1.3.3.4 心肌組織SOD的測定:①測定原理:黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應系統(tǒng)可產生超氧陰離子自由基，此物質可氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下顯示紫紅色，用可見光分光光度計可測其吸光度值。SOD是自由基清除酶，被測樣品中含有的SOD對超氧陰離子自由基有專一性的抑制作用，可使形成的亞硝酸鹽減少，紫紅色顯色物含量減少，比色時測定管的吸光度值低于對照管。通過公式計算可求出被測樣品的SOD活力。②測定方法:混勻，室溫放置10 min，550 nm處，1 cm光徑，蒸餾水調零，比色讀取吸光度值(OD)。見表3。③SOD活力計算:單位定義:每毫克組織蛋白在1 ml反應液中SOD抑制率達50%時所對應的SOD量為一個SOD活力單位(U)。=計算公式:組織SOD(U/mgprot)=50% ×組織中蛋白含量(mgprot/ml)。見表3。

表2 心肌組織XOD測定方法

表3 心肌組織SOD測定方法

1.4 統(tǒng)計學分析應用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件，計量資料以±s表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

IR組動物心肌組織MDA、XOD、SOD水平與Control組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表4。

表4 2組心肌組織觀察指標水平比較n=10，±s

表4 2組心肌組織觀察指標水平比較n=10，±s

注:與 Control組比較，*P ＜0.01

組別 MDA(nmol/mgprot) XOD(U/gprot) SOD(U/mgprot)Control組5.0 ±0.4 68 ±10 19.9 ±1.0 IR 組 7.7 ±0.8* 83 ±5* 12.5 ±1.6*

3 討論

組織、器官的IR除可造成組織、器官本身嚴重的病理改變外，伴隨著機體內環(huán)境的破壞，代謝的紊亂，損傷還可由局部波及遠端臟器。LIR在引起缺血肢體損傷的同時，也可繼發(fā)其他遠隔組織器官的病理變化［2］，嚴重時引起多器官功能障礙綜合征［3］(MODS)，心肌的損傷便是MODS的重要表現(xiàn)之一。

3.1 心外因素造成心肌組織損傷的實驗依據 研究表明，機體經受嚴重創(chuàng)傷、嚴重感染、缺血再灌注損傷等劇烈應激反應時，心臟可能發(fā)生可逆轉或不可逆轉的損傷性變化［4］。姚季生等［5］經尾靜脈給大鼠注射去甲腎上腺素，發(fā)現(xiàn)心肌有多灶性壞死且病灶內心肌深嗜伊紅性改變，部分肌原纖維斷裂溶解等病理改變。在下肢IR中，心、肺是最易受累的遠位靶器官［6］。有文獻報道，LIR引起的氧化應激反應可造成肺水腫甚至呼吸功能障礙［7］。遭受一段時間缺血損傷的肢體，恢復血液灌流后不僅發(fā)生局部骨骼肌的再灌注損傷(reperfusion injury，RI)，機體還可能出現(xiàn)血壓進行性降低的全身應，稱為止血帶休克(tourniquet shock，ToS)。Jesse等［8］對止血帶引發(fā)休克進行研究時發(fā)現(xiàn)，止血帶使用3 h以上休克發(fā)生的可能性極大。任會榮等［9］建立肢體束縛應激動物模型，也觀察到心肌線粒體膜明顯的損傷變化。骨骼肌細胞缺血一定時間后恢復血流灌注，細胞損傷胞漿內容物釋放入血，血液性狀及成分明顯異常［10］。心臟是接受下肢血液回流的第一站。再灌注血液經下腔靜脈到右心房再灌流全心，缺血期生成的毒性代謝產物及再灌注期形成的大量炎性介質，會隨著再灌注血流到達心臟并進一步播散到全身。心臟需氧量大，能量代謝過程復雜，下肢的IR可經多種機制影響心肌的代謝和功能活動，造成心肌組織損傷。

3.2 氧自由基的損傷作用 氧自由基化學性質較為活潑，可破壞機體正常氧化/還原的動態(tài)平衡，形成嚴重的氧化應激(oxidative stress)狀態(tài)，對生物大分子(核酸、蛋白質、脂質)造成過氧化性損傷，影響正常的生命活動。LIR過程中體內有大量的自由基產生，這可作為缺血再灌注造成遠位器官損傷的主要機制。其中氧自由基(OFR)可通過級聯(lián)反應損傷心肌細胞膜及心臟血管內皮細胞。MDA性質穩(wěn)定，是OFR攻擊膜性成分多不飽和脂肪酸的終產物，它還可以進一步引起蛋白質、磷脂和核酸的交聯(lián)而加重組織損傷。組織MDA水平可作為反映自由基損傷程度的指標［11］。XOD是生成OFR的催化酶，其在催化次黃嘌呤及黃嘌呤代謝的過程中，有大量超氧陰離子(O2產生。SOD是一種金屬蛋白，可以歧化O2生成 H2O2并可進一步清除 H2O2，是體內主要的酶性自由基清除劑。MDA、XOD、SOD可作為機體脂質過氧化損傷程度的間接指標。實驗結果顯示:與Control組比較，在經受LIR的2組心肌組織中SOD含量降低(P＜0.01)，而XOD和MDA含量均明顯增加(P＜0.01)，提示心肌組織中自由基產生過多，心臟及整個機體處于氧化應激狀態(tài)。SOD含量的降低與缺血缺氧使其生成不足［12］和清除自由基時消耗過多有直接關系。氧自由基相關指標說明了LIR造成心肌損傷。

綜上所述，大鼠LIR可引起心肌損傷。機體的氧化應激狀態(tài)可能是LIR繼發(fā)心臟損傷的主要機制之一。

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