曹寶森 李 霞 康 劍云 常 茂葉 張 凡 劉 寶生 王新生

成熟淋巴細胞歸巢到特定區(qū)域是穿越高內皮微靜脈并進入外周器官的定向遷移，是一個高度調節(jié)的過程，關鍵步驟包括貼壁、滾動，粘附、捕獲及遷移。而腫瘤淋巴結轉移中的作用機制尚不清楚，但與淋巴歸巢有相似之處。CD62L表達上調在T細胞貼壁滾動過程中發(fā)揮重要作用。黏膜地址素細胞粘附分子(MadCAM-1)是外周淋巴結血管地址素，與相應受體的結合誘導淋巴細胞的游走和歸巢過程，然而關于CD62L、Mad-CAM-1在非小細胞肺癌表達研究尚少。筆者通過免疫組化染色分析CD62L、MadCAM-1在非小細胞肺癌、轉移淋巴結和正常肺組織、無轉移淋巴結中的表達，探討CD62L、MadCAM-1表達與肺癌發(fā)展以及淋巴結轉移之間的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2007年1月至2011年12月河北北方學院附屬第二醫(yī)院、河北北方學院附屬第一醫(yī)院住院的手術切除后經(jīng)病理診斷為非小細胞肺癌患者60例，其中腺癌20例，鱗癌24例，腺鱗癌10例，大細胞未分化癌6例;肺癌轉移淋巴結30例，無肺癌轉移淋巴結30例，正常肺組織30例。所有患者術前未經(jīng)化療和放療，無其他惡性腫瘤史。所有標本均經(jīng)病理確診。

1.2 免疫組化染色 一鼠抗人單克隆抗體購自武漢博士德試劑公司，組織石蠟塊包埋，4 μm連續(xù)切片。主要免疫組化步驟:二甲苯脫蠟、梯度酒精至水，3%雙氧水滅活內源性過氧化酶，PBS緩沖液振洗，微波爐進行抗原熱修復，正常山羊血清封閉、一抗冰箱過夜，二抗 、三抗各1 h，DAB顯色10～15 min，復染核脫水透明，中性樹膠封片。結果判斷:著色細胞＜10%為陰性，＞10%為陽性。CD62L陽性物質定位在腫瘤細胞質和細胞膜，MadCAM-1陽性部位定位在高內皮微靜脈內皮細胞漿和細胞膜。采用HIPAS100圖象分析軟件對所有切片進行圖象分析，首先低倍鏡尋找每張切片著色的典型區(qū)域，每張切片隨機選取10個著色典型區(qū)域且不重復的視場，放大400倍鏡下測量每個視場中陽性灰度單位，取其均數(shù)即為該切片的著色強度(即灰度單位)。

1.3 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件，不同組間表達率的比較采用Fisher精確概率法，各指標在同一組間的表達水平以及與浸潤程度之間作直線回歸相關分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CD62L的表達率情況 CD62L在腫瘤組織中表達在腫瘤細胞、脈管內癌栓、間質浸潤的淋巴細胞;在轉移淋巴結主要表達在轉移灶腫瘤細胞、脈管內癌栓以及淋巴細胞;在正常肺組織以及無轉移淋巴結主要表達在成熟淋巴細胞;CD62L在癌組織中表達高于正常肺組織(P＜0.05);轉移淋巴結中的表達高于無轉移淋巴結表達(P＜0.05);CD62L在轉移淋巴結中表達與癌組織中的表達相比無差異(P＞0.05);CD62L在正常肺組織表達與無轉移淋巴結表達無差異(P＞0.05);CD62L在癌組織中陽性表達率65%(39/60)明顯高于正常肺組織10%(3/30)(P＜0.05);轉移淋巴結中的陽性表達率70%(21/30)明顯高于無轉移淋巴結陽性表達率17%(5/30)(P＜0.05);CD62L在轉移淋巴結中表達率與癌組織中的表達率相比無差異(P＞0.05);CD62L在正常肺組織表達率與無轉移淋巴結表達率無差異(P ＞0.05)。

2.2 MadCAM-1的表達率情況 MadCAM-1主要表達淋巴結濾泡間區(qū)的高內皮后微靜脈內皮細胞;在癌組織中的高內皮微靜脈無表達;轉移淋巴結中的陽性表達率70%(21/30)高于無轉移淋巴結表達率40%(12/30)。

2.3 CD62L、MadCAM-1表達水平與肺癌臨床病理特征的關系CD62L的陽性表達水平(即灰度單位)與淋巴結轉移、脈管內癌栓、TNM分期之間存在密切相關，與腫瘤體積、細胞分化程度、侵犯肺膜無關;MadCAM-1的陽性表達水平與淋巴結轉移、脈管內癌栓、腫瘤體積存在明顯相關，與細胞分化、侵犯肺膜、腫瘤分期無明顯相關。見表1。

2.4 CD62L、MadCAM-1表達水平間的相關分析 CD62L及其受體MadCAM-1表達在肺癌組織以及轉移淋巴結中表達之間存在密切相關(r=0.7081，P=0.002);CD62L及其受體Mad-CAM-1表達在肺癌組織以及無轉移淋巴結中表達之間不存在相關(P ＞0.05)。

3 討論

腫瘤細胞向遠隔器官的轉移是有選擇性而非隨機的，非常類似淋巴細胞的歸巢現(xiàn)象，目前有3種理論來解釋這種歸巢現(xiàn)象:(1)選擇性生長，即腫瘤細胞從血液循環(huán)或者淋巴循環(huán)向組織內的滲透是廣泛存在的，但只在具有適合的生長因子和細胞外基質的環(huán)境中生存。(2)腫瘤細胞只選擇性地在歸巢器官的內皮表面附著生長。(3)腫瘤細胞只向產(chǎn)生特異的水溶性的吸附因子的器官趨化。上述機制在實驗動物的轉移觀察中或多或少存在，但目前的實驗證據(jù)還無法完全解釋腫瘤細胞的偏好性轉移。

表1 CD62L、MadCAM-1在非小細胞肺癌的表達水平與臨床病理特征的關系±s

表1 CD62L、MadCAM-1在非小細胞肺癌的表達水平與臨床病理特征的關系±s

注:tc代表CD62L;tM代表MadCAM-1

病理參數(shù) CD62L MadCAM-1 t值 P值臨床分期Ⅰ、Ⅱ期(n=36) 26.3 ±3.4 21.0 ±2.2 t c=4.9921 ＜0.05Ⅲ、Ⅳ期(n=24) 42.3 ±3.5 22.4 ±2.0 t M=2.5406 ＞0.05腫瘤直徑(cm)≤3(n=25) 22.3 ±1.7 23.3 ±1.4 t c=2.8451 ＞0.05＞3(n=35) 22.1 ±3.7 34.3 ±3.0 t M=4.6723 ＜0.05分化程度高分化(n=30) 21.0 ±2.1 25.3 ±4.9 t c=2.2917 ＞0.05中、低分化(n=30) 24.2 ±3.0 23.8 ±2.1 t M=2.3453 ＞0.05有無淋巴結轉移無淋巴結轉移(n=30) 22.2 ±1.3 21.5 ±2.0 t c=5.6632 ＜0.05淋巴結轉移(n=30) 40.5 ±2.6 40.4 ±1.6 t M=6.3346 ＜0.05有無浸潤未浸潤肺膜(n=35) 22.2 ±1.7 22.2 ±1.9 t c=1.8042 ＞0.05浸潤肺膜(n=25) 21.5 ±2.5 22.5 ±2.6 t M=2.0216 ＞0.05有無脈管內癌栓無脈管內癌栓(n=32) 21.7 ±2.6 23.2 ±3.7 t c=4.7802 ＜0.05有脈管內癌栓(n=28) 32.4 ±4.9 40.2 ±5.0 t M=5.0216 ＜0.05

淋巴細胞歸巢的關鍵步驟是貼壁，而CD62L介導的淋巴細胞與內皮細胞的初始粘附在此過程中起關鍵作用。CD62L又稱淋巴細胞歸巢受體(lymphocytehoming receptor，LHR)。由Gallatin和Tedder等首先在小鼠淋巴細胞上發(fā)現(xiàn)，其分子質量為140 kD，CD62L分子內具有類似凝集素樣的細胞外結構，通過鈣依賴性方式與細胞表面糖蛋白相互作用。CD62L表達于大多數(shù)B細胞和未致敏T細胞以及多數(shù)單核細胞、中性粒細胞和嗜酸性粒細胞［1］。CD62L通過識別外周淋巴結高內皮靜脈(HEV)內皮細胞表達的外周淋巴結地址素(peripheral node addressins，PNAd)介導淋巴細胞歸巢到外周淋巴結。CD62L的正常功能是作為淋巴細胞到達外周淋巴結的歸巢受體［2］。而Alcaide等用胰島素啟動子調控猴病毒40T抗原表達的轉基因鼠可產(chǎn)生特異向肝臟轉移的胰島β細胞瘤，沒有淋巴轉移;而在胰島啟動子調控下同時表達猴病毒40T抗原和L-選擇素的轉基因鼠可產(chǎn)生特異性向淋巴結轉移的胰島β細胞瘤，且這種轉移能被L-選擇素蛋白的抗體所阻斷［3］，說明L-選擇素可協(xié)助腫瘤細胞發(fā)生淋巴轉移。另有研究發(fā)現(xiàn)肝癌細胞表面有CD62L的表達，可協(xié)助腫瘤細胞與淋巴結黏附，從而可能介導向淋巴道轉移。采用單引物擴增法標記的基因芯片技術篩選乳腺原發(fā)癌與淋巴結轉移癌的差異表達基因，發(fā)現(xiàn)CD62L在淋巴結轉移癌中表達上調［4，5］。CD62L在腫瘤組織中表達在腫瘤細胞、脈管內癌栓、間質浸潤的淋巴細胞;在轉移淋巴結主要表達在轉移灶腫瘤細胞、脈管內癌栓以及淋巴細胞;在正常肺組織以及無轉移淋巴結主要表達在成熟淋巴細胞;CD62L在癌組織中表達高于正常肺組織;轉移淋巴結中的表達高于無轉移淋巴結表達;CD62L在轉移淋巴結中表達與癌組織中的表達相比無差異;CD62L在正常肺組織表達與無轉移淋巴結表達無差異;CD62L在癌組織中陽性表達率明顯高于正常肺組織;轉移淋巴結中的陽性表達率明顯高于無轉移淋巴結陽性表達率;CD62L在轉移淋巴結中表達率與癌組織中的表達率相比無差異;CD62L在正常肺組織表達率與無轉移淋巴結表達率無差異;相關分析顯示:CD62L的陽性表達水平(即灰度單位)與淋巴結轉移、脈管內癌栓、TNM分期之間存在密切相關，與腫瘤體積、細胞分化程度、侵犯肺膜無關;說明CD62L不僅介導正常肺組織間質慢性炎癥中淋巴細胞的歸巢，而且參與肺癌細胞的淋巴結轉移。腫瘤細胞通過上調CD62L表達粘附到內皮細胞表面，進入脈管系統(tǒng)形成癌栓;同時隨腫瘤臨床分期的增加，血管新生更加明顯，管壁的不完整和低壓力便利腫瘤細胞進入脈管系統(tǒng);同時我們試驗也觀察到表達CD62L的腫瘤細胞分布大多臨近血管豐富區(qū)域，并且脈管內癌栓的表達呈現(xiàn)強弱不等現(xiàn)象，淋巴結轉移灶中表達較強，而腫瘤組織脈管中癌栓表達較弱，推測CD62L的表達水平與其所處的狀態(tài)密切相關，位于腫瘤組織內的癌栓低表達，便利腫瘤細胞脫離初期與內皮細胞粘附而進入血流;淋巴結中的過表達便利腫瘤細胞與HEV的內皮細胞粘附游出脈管，完成最終的轉移。

MadCAM-1是一種未分類的細胞粘附分子，主要表達在HEV的內皮細胞，與相應的受體CD62L結合介導黏膜相關組織的淋巴細胞的歸巢。有研究發(fā)現(xiàn)炎性腸病患者粘膜下淋巴小結內以及固有層內的高內皮微靜脈過表達，而敲除Mad-CAM-1基因的小鼠免疫力低下，甚至于胚胎期死亡［6，7］。在大腸癌研究中發(fā)現(xiàn)MadCAM-1的表達降低，而且與腫瘤組織內淋巴細胞的浸潤程度密切相關，淋巴結轉移率高于無下降組，但與脈管內癌栓以及新生血管密度無明顯相關，而且在胃癌研究中未發(fā)現(xiàn)MadCAM-1的下降［8，9］。乳腺癌樣本中研究發(fā)現(xiàn)淋巴結轉移患者同時存在腫瘤周圍高內皮微靜脈樣變，而且轉移淋巴結副皮質區(qū)的HEV內皮高表達MadCAM-1，而且脈管內癌栓發(fā)生率明顯高于低表達組［10］。因此推測腫瘤細胞借助Mad-CAM-1的趨化作用，粘附表達相應抗體或被表達相應抗體免疫細胞包繞的癌栓，在進入脈管系統(tǒng)和穿出脈管系統(tǒng)等環(huán)節(jié)發(fā)揮作用，完成淋巴結轉移。我們的研究顯示MadCAM-1主要表達淋巴結濾泡間區(qū)的高內皮后微靜脈內皮細胞;在癌組織中的高內皮微靜脈無表達;轉移淋巴結中的陽性表達率高于無轉移淋巴結表達率。MadCAM-1的陽性表達水平與淋巴結轉移、脈管內癌栓、腫瘤體積存在明顯相關，與細胞分化、侵犯肺膜、腫瘤分期無明顯相關。說明MadCAM-1在血管內皮表達參與肺癌的淋巴結轉移，其與表達受體CD62L的腫瘤細胞或被免疫細胞包繞表達CD62L的癌栓結合，介導脈管內的腫瘤細胞粘附到表達地址素的HEV，穿越血管進入淋巴結，完成轉移。同時隨腫瘤體積增加，新生血管增多，進入脈管形成癌栓機會增多，在淋巴結形成轉移灶的機會增加。

CD62L及其受體MadCAM-1表達在肺癌組織以及轉移淋巴結中表達之間存在密切相關;CD62L及其受體MadCAM-1表達在肺癌組織以及無轉移淋巴結中表達之間不存在相關。說明兩者在肺癌的淋巴結轉移過程中其協(xié)同作用，可能是腫瘤細胞過表達CD62L的同時，通過某種機制同時上調HEV內皮細胞MadCAM-1的表達，為淋巴結轉移奠定分子基礎，使淋巴結轉移發(fā)生幾率增加。

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