劉曉松，鄭 玲，黃文雯，盧 煒，寧恩創(chuàng)，方曉明

(1．廣西出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，廣西 南寧 530021;2．廣西大學(xué) 輕工與食品工程學(xué)院，廣西 南寧 530004;3．上海出入境檢驗檢疫局 動植物與食品檢驗檢疫技術(shù)中心，上海 200135)

苯并咪唑類是高效、廣譜的內(nèi)吸性殺菌劑，對植物病害具有很強的抗菌活性，可用于植物真菌等病蟲害的防治［1－2］。常用的苯并咪唑類殺菌劑有苯菌靈、甲基硫菌靈、2-氨基苯并咪唑、噻菌靈和多菌靈，其性質(zhì)與作用各不相同;其中苯菌靈能防治水果的真菌病害、螨類等，但會引起哺乳動物染色體變化、抵制蛋白合成［3］;多菌靈能有效抑制病原菌的繁殖、生長［4］，但殘效期長，易在植物體內(nèi)富集［5］;甲基硫菌靈對真菌的防治效果顯著，廣泛應(yīng)用于重要作物［6］，在植物體內(nèi)可代謝為多菌靈［7］;噻菌靈主要應(yīng)用于果蔬的防腐，是一種會使小鼠腎致畸的物質(zhì)［8］，其代謝產(chǎn)物是5-羥基噻菌靈;2-氨基苯并咪唑具有強殺菌、抗菌能力，但其分子量很低，難以分解及轉(zhuǎn)化，從而對環(huán)境造成威脅?；谶@些殺菌劑的危害性，美國、日本等國家現(xiàn)已嚴(yán)格控制食品中該類物質(zhì)的殘留量，目前各國對該類殺菌劑在水果和果汁中的最高殘留量為0.05～20 mg/kg［9］，我國也已將食品中苯并咪唑類殺菌劑的殘留量列為重要監(jiān)測項目。

目前國內(nèi)外對該類殺菌劑的檢測方法主要有HPLC法［10－14］、LC－MS/MS法［15－16］等。這些方法主要檢測水果及水果制品中多種農(nóng)藥的殘留，針對濃縮果汁中苯并咪唑類殺菌劑的研究很少。已有方法中針對單一殺菌劑檢測的研究多，而多種殺菌劑同時檢測的研究較少，幾乎沒有涉及代謝物檢測的研究。為有效監(jiān)控濃縮果汁的質(zhì)量安全，便于國內(nèi)各檢驗機構(gòu)的日常檢測及各濃縮果汁的產(chǎn)品質(zhì)量控制，本文建立了一種簡單有效、準(zhǔn)確可靠且能同時檢測甲基硫菌靈、2-氨基苯并咪唑、噻菌靈、多菌靈、5-羥基噻菌靈殘留的分析方法。

1 實驗部分

1.1 材料、試劑與儀器

蘋果、菠蘿、荔枝、芒果、橙子、西番蓮、梨 7種濃縮果汁;標(biāo)準(zhǔn)品:2-氨基苯并咪唑(Dr.Ehrenstorfer，德國)、多菌靈、噻菌靈、5-羥基噻菌靈、甲基硫菌靈(Sigma－Aldrich，美國)，5種標(biāo)準(zhǔn)品純度均大于97%;PSA小柱(500 mg/6 mL，CNW Technologies GmbH);乙腈、甲苯、乙酸銨、甲醇、甲酸(HPLC級，TEDIA Company);磷酸氫二鈉、氯化鈉(AR級，成都市科龍化工試劑廠)。

液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀(Agilent RRLC1200+Agilent 6410B，美國)，配電噴霧源(ESI);pH計;振蕩器;高速離心機(10 000 r/min);真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;Milli-Q超純水器。

1.2 實驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:用分析天平分別稱取0.010 g的標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇配制成100 mg/L的單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液，于－18℃下避光保存;混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:用5種單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液，根據(jù)實驗需要稀釋配制成0.2、0.1、0.08、0.04、0.02 mg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 色譜條件 色譜柱為ZORBAX Eclipse XDB－C18柱，4.6 mm×50 mm，粒徑為1.8 μm(Agilent公司);流動相:0.1%甲酸－10 mmol/L乙酸銨(A)和甲醇(B)梯度洗脫;洗脫程序:編制洗脫曲線，起始狀態(tài)為90%A，在0～7 min，使A相降至20%，保持2 min后，在1 min內(nèi)使A相降至0%，保持4 min，之后在1 min內(nèi)將A相從0%升至90%，保持5 min后恢復(fù)起始狀態(tài);流速:0.4 mL/min;進樣體積:10 μL;柱溫:40℃。

1.2.3 質(zhì)譜條件 離子源:電噴霧離子源ESI;掃描方式:正離子掃描;檢測方式:多反應(yīng)監(jiān)測(MRM);毛細管電壓:4 000 V;霧化氣溫度:350℃;霧化氣流量:12 L/min;霧化氣壓力(氮氣):40 psi。

1.2.4 樣品提取 稱濃縮果汁樣品2 g(精確至0.001 g)于50 mL離心管中，加入10 mL至20 mol/L的Na2HPO4緩沖溶液、3 g氯化鈉混勻，用2 mol/L的NaOH溶液調(diào)pH值至8.5～8.6，加入10 mL乙

腈振蕩提取15 min，8 000 r/min條件下離心10 min，取上清液，重復(fù)提取操作1次，合并上清液并定容至20 mL。取10 mL上清液至100 mL的雞心瓶中，40℃真空旋轉(zhuǎn)濃縮至1.5～2 mL，待凈化。

1.2.5 凈 化 在PSA柱中加入1.0 g(精確至0.01 g)無水硫酸鈉，用4 mL乙腈－甲苯溶液(3∶1)活化柱子，待液面到達固體面時，迅速將濃縮液上柱，再用2 mL乙腈－甲苯溶液(3∶1)洗滌雞心瓶并過柱，重復(fù)操作3次。最后用15 mL乙腈－甲苯溶液(3∶1)洗脫，收集全部柱流出液于100 mL雞心瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至1.5～2 mL，轉(zhuǎn)移至15 mL的離心管中，并用3 mL乙腈－甲苯溶液(3∶1)洗滌雞心瓶2次，合并洗滌液至15 mL離心管中，于40℃水浴下用氮氣吹至近干。用1 mL流動相定容并超聲3～5 min，混勻，過0.22 μm有機相濾膜，LC－MS/MS測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的確定

分別配制1 mg/L的2-氨基苯并咪唑、5-羥基噻菌靈、多菌靈、噻菌靈、甲基硫菌靈標(biāo)準(zhǔn)溶液，選擇ESI+電離模式，對霧化氣溫度、霧化氣流量、源內(nèi)碎裂電壓及碰撞能量等條件進行優(yōu)化。經(jīng)反復(fù)測試、優(yōu)化，得到5種待測物的質(zhì)譜條件如表1所示。

表1 5種殺菌劑及代謝物的質(zhì)譜條件Table 1 MS parameters of 5 pesticides and its metabolites

2.2 樣品定容液的選擇

樣品定容液的組成對各物質(zhì)在色譜柱中的分離行為和離子化效率即質(zhì)譜檢測的靈敏度有一定的影響。本文分別以純甲醇、甲醇－水(1∶1)和甲醇－緩沖鹽溶液(10 mmol/L乙酸銨－0.1%甲酸，1∶9)作為定容液進行檢測。結(jié)果顯示，隨著定容液中甲醇含量的升高，待測物的峰形逐漸展寬，以純甲醇作為定容體系時，2-氨基苯并咪唑的峰有拖尾現(xiàn)象;以甲醇－緩沖鹽溶液(10 mmol/L乙酸銨－0.1%甲酸，1∶9)作為定容液時，各待測物的峰形及分離均較好，響應(yīng)值滿足檢測要求。在選定條件下，混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖及5種殺菌劑及代謝產(chǎn)物的定量離子色譜圖如圖1所示。

2.3 樣品前處理條件的選擇

2.3.1 提取條件的選擇 據(jù)文獻［12－13］報道，樣品溶液pH值對待測物的提取有較大的影響。將樣品溶液的pH值分別調(diào)為7.0、8.0、9.0、10.0、12.0，實驗顯示，當(dāng)pH值為12.0時，只有多菌靈、噻菌靈出峰;當(dāng)pH值為10.0時，甲基硫菌靈未出峰;當(dāng)pH值為7.0、8.0、9.0時，5種待測物均出峰，但pH值7.0時，2-氨基苯并咪唑的提取效果較差;當(dāng)pH值為8.0、9.0時，5種待測物的提取較好，但各待測物的回收率有差異。進一步將樣品溶液的pH值分別調(diào)為8.0、8.2、8.4、8.5、8.6、8.8、9.0，結(jié)果顯示，pH值低于8.5時，2-氨基苯并咪唑的回收率偏低，pH值高于8.6時，甲基硫菌靈的回收率偏低。綜合考慮各待測物的回收率，最終確定提取樣液的pH值為8.5～8.6。

2.3.2 樣品凈化條件的確定 比較了MCX柱、NH2柱、C18柱、NH2柱+活性碳柱和PSA柱對樣品的凈化效果。結(jié)果表明，用C18柱凈化時5種待測物的回收率均較低，且LC－MS/MS測定時有雜峰干擾;用MCX柱、NH2柱和NH2柱+活性碳柱凈化時，2-氨基苯并咪唑的回收率較差;用PSA柱凈化時，由于PSA柱的極性比NH2柱弱，對2-氨基苯并咪唑的吸附力相對較弱，使其洗脫效果顯著，5種待測物回收率均滿足檢測要求，且效果穩(wěn)定，所以凈化柱選用PSA柱。

圖1 5種殺菌劑及代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖及其色譜圖Fig.1 TIC spectrum of standard mixture of 5 pesticides and its metabolites and their chromatograms

2.4 線性范圍與定量下限

準(zhǔn)確稱取2 g(精確至0.001 g)樣品，按“1.2”方法進行處理，以獲得的基質(zhì)溶液為溶劑，配制質(zhì)量濃度為0.2、0.1、0.08、0.04、0.02 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。在優(yōu)化條件下進行測定，以質(zhì)量濃度(x，mg/L)為橫坐標(biāo)、峰面積(y)為縱坐標(biāo)進行回歸分析，得到各待測物的線性方程和相關(guān)系數(shù)(見表2)。結(jié)果表明各待測物在0.02～0.2 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均不小于0.998 5。

表2 5種待測物的線性方程及相關(guān)系數(shù)Table 2 Calibration curves and correlation coefficients(r)of five analytes

對各種基質(zhì)的陰性樣品進行加標(biāo)實驗，以信噪比(S/N)≥10計算得到2-氨基苯并咪唑和5-羥基噻菌靈的定量下限為2.0 μg/kg，多菌靈、噻菌靈和甲基硫菌靈的定量下限為1.0 μg/kg。

2.5 回收率與精密度

在蘋果、芒果、菠蘿、梨、橙、荔枝、西番蓮7種濃縮果汁的陰性樣品中分別添加MBC、TBZ、TM為1、2、10 μg/kg，2-AB、5-OH-TBZ為2、4、20 μg/kg 3個不同水平的待測物標(biāo)準(zhǔn)品，每個水平重復(fù)測定6次，各待測物的平均回收率在70%～110%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.1%～10.9%(見表3)。

2.6 實際樣品的檢測

在市場上隨機抽取市售橙子、荔枝、蘋果、西番蓮、梨汁、菠蘿、芒果濃縮果汁樣品，按本方法進行檢測。檢測蘋果汁樣品7個，其中檢出2-氨基苯并咪唑殘留量為1.8～25.7 μg/kg，多菌靈1.3～20.2 μg/kg;荔枝汁樣品3個，其中檢出多菌靈殘留量為1.3～20.2 μg/kg;菠蘿汁樣品3個，其中檢出2-氨基苯并咪唑殘留1.1 μg/kg，多菌靈殘留1.0～1.4 μg/kg;橙子汁樣品1個，檢出多菌靈殘留1.2 μg/kg。以上所檢出的殘留量，均遠低于國際組織及我國規(guī)定的最大殘留限量值，證明本方法靈敏、高效，可用于國內(nèi)各檢驗機構(gòu)的日常檢測及各濃縮果汁生產(chǎn)廠的產(chǎn)品質(zhì)量控制。

表3 7種濃縮果汁樣品的加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 3 Recoveries and relative standard deviations of five target compounds in seven kinds of concentrated fruit juice(n=6)

3 結(jié)論

本文建立了一種能同時檢測濃縮果汁中甲基硫菌靈、2-氨基苯并咪唑、噻菌靈、多菌靈、5-羥基噻菌靈殘留的液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法。方法的回收率在70%～110%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.1%～10.9%之間，2-氨基苯并咪唑和5-羥基噻菌靈的定量下限為2.0 μg/kg，多菌靈、噻菌靈、甲基硫菌靈的定量下限均為1.0 μg/kg。實際樣品測試表明:該方法能有效檢測出濃縮果汁中5種殺菌劑及其代謝物的殘留量，方法具有靈敏、穩(wěn)定、可靠的特點，為監(jiān)控我國濃縮果汁的質(zhì)量安全提供了一個行之有效的途徑。

［1］ Li H X，Lu Y J，Zhou M G．Chemical Control of Plant Diseases in China.3rd．Beijing:China Agricultural Science and Technology Publing House．(李紅霞，陸悅健，周明國．中國植物病害化學(xué)防治研究．第三卷．北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社)，2002:24－32．

［2］ Zhu B L，Jiang J S．Source of Animal Drug Residues in Food．Shanghai:Shanghai Publishing House of Science and Technology(朱蓓蕾，蔣金書．動物源食品藥物殘留．上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社)，1994:56．

［3］ Banks D，Soliman M R．J.Toxicol．，1997，116:177 －181．

［4］ World Health Organisation．Environmental Health Criteria 149．Geneva，1993:1 －125．

［5］ De la Huebra M J G，Nieto P H O，Ballestero Y，Hernandez L．J.Anal.Chem．，2002，367:474－478．

［6］ Traina M E，F(xiàn)azzi P，Macrì C，Ricciardi C，Stazi A V，Urbani E，Mantovani A．J.Appl.Toxicol．，1998，18:241 －248．

［7］ Ogata A，Ando H，Kubo Y，Hiraga K．J.Food Chem.Toxicol．，1984，22:509 －520．

［8］ Mizutani T，Ito K，Nomura H，Nakanishi K．J.Food Chem.Toxicol．，1990，(28):169 －177．

［9］ Zhuang W J．International Food Feed Pesticide Regulations(Volume 1 －4)．Beijing:Chemical Industry Press(莊無忌．國際食品飼料中農(nóng)藥殘留限量法規(guī)(第1－4卷)．北京:化學(xué)工業(yè)出版社)，2010．

［10］ Chen Y，Cong P H，Nie J Y，Li J，Xu G F．J.Fruit Sci.(陳瑩，叢佩華，聶繼云，李靜，徐國鋒．果樹學(xué)報)，2008，25(5):769－773．

［11］ Li H F，Li J，Xu G F，Nie J Y．Mod.Agric.Sci.Technol.(李海飛，李靜，徐國鋒，聶繼云．現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技)，2009，1:114－116．

［12］ Liu X S，Tong Z F，Zheng L，Zhuo H H，Liu J Y．J.Anal.Sci.(劉曉松，童張法，鄭玲，卓海華，劉軍義．分析科學(xué)學(xué)報)，2007，23(3):311－314．

［13］ Banerjee K，Oulkar D，Patil S，Jadhav M，Dasgupta S，Patil S，Bal S，Adsule P．J.Agric.Food Chem.，2009，57:4068－4078．

［14］ Dong A J，Yang X，Ma Y，Zhang H，Zhang Y C，Wang J．J.Instrum.Anal.(董愛軍，楊鑫，馬鶯，張華，張英春，王靜．分析測試學(xué)報)，2010，29(6):573－577．

［15］ Blasco C，F(xiàn)ont G，Manes J，Pico Y．Anal.Chem．，2003，75(14):3606－3615．

［16］ Jansson C，Pihlstr m T， sterdahl B G，Markides K E．J.Chromatogr.A，2004，1023:93 －104．