于相麗，李勇慧，秦 磊

(洛陽師范學(xué)院生命科學(xué)系，河南洛陽471022)

0 引言

茜草(Rubia Cordifolia L.)為茜草科茜草屬植物，別名活血草、鋸子草、拉拉草、血見愁等。分布于歐洲、亞洲、美洲和南部非洲［1］。中國(guó)有12 種［2］，主產(chǎn)于陜西省、江蘇省、安徽省、河南省、山東省。茜草為中國(guó)傳統(tǒng)常用中藥之一，藥用其干燥根及根莖，有涼血、止血、祛瘀、通經(jīng)等功效［3］。

目前，國(guó)內(nèi)對(duì)茜草的化學(xué)成分和藥理作用有廣泛的研究，茜草中主要含有水溶性的環(huán)已肽類系列物質(zhì)，脂溶性成分蒽醌及其糖苷、萘醌及其糖苷，此外還含有萜類、β 谷甾醇、脂肪酸化合物和微量元素［4－5］。現(xiàn)代藥理研究證明:茜草根水提液在體外對(duì)金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、流感桿菌和部分皮膚真菌等均有一定的抑制作用［6］，但是對(duì)茜草有機(jī)溶劑的提取及根不同部位的抑菌效果沒有系統(tǒng)的試驗(yàn)研究。本文采用不同濃度的乙醇作溶劑，研究茜草根不同部位提取液對(duì)常見的3 種細(xì)菌的抑菌效果，以期為茜草的質(zhì)量控制和臨床使用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)所用茜草于2010 年9 月份采挖于洛陽市孟津縣，陰干后將其根分為3 類，即塊狀的基部根、直徑＞8 mm 的粗根以及直徑＜8 mm 的細(xì)根，分別粉碎并密封保存。

1.2 菌種

供試菌種為大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，由洛陽師范學(xué)院生命科學(xué)系微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 主要儀器設(shè)備

QYC-2102 大容量雙層全溫?fù)u床(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司);SW-CJ-2F 型雙人雙面凈化工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司);101-1AB 型電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司);DK-98-IIA電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司);LDZX-40KB 不銹鋼立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠);RE-201C 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)。

1.4 培養(yǎng)基與試劑

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基［7］:牛肉膏，蛋白胨，瓊脂，NaCl(HCl 或NaOH 調(diào)pH 值7.2 ～7.4)。

試劑為無水乙醇，無菌生理鹽水等。

1.5 方法

1.5.1 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇提取物的制備［8］

取干燥粉碎后的茜草根樣品10 g 置于錐形瓶中，加蒸餾水100 mL，55 ℃水浴1 h 后，過濾，殘?jiān)诱麴s水100 mL 于55 ℃水浴1 h，再重復(fù)1 次，最后將3 次濾液合并，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將濾液濃縮至黏著狀，用水溶解并定容10 mL，制成1 g/mL 的水懸濁液。以上述方法分別獲得體積分?jǐn)?shù)分別為0%、50%、60%、70%、80%的茜草根提取液，依次標(biāo)記為0%、50%、60%、70%、80%，備用。

1.5.2 菌懸液的制備

將供試菌種置于滅菌的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，在37 ℃、120 r/min 的搖床上培養(yǎng)24 h，經(jīng)涂片鏡檢確定為單一菌種后，用無菌生理鹽水將菌液稀釋成0.5 ×109個(gè)/mL 左右。將該菌液置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.3 藥敏紙片法測(cè)定抑菌圈［9］

用打孔器將濾紙打成孔徑為5 mm 的圓紙片，高壓蒸汽滅菌。分別取3 mL 的0%提取液的基部根、粗根、細(xì)根原液于滅菌平皿中，加入等體積的蒸餾水，將滅菌濾紙浸泡30 min 后，置于55 ℃的干燥箱中烘干制成藥敏紙片。在超凈工作臺(tái)上將滅菌后的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基倒入無菌平皿中，每皿約20 mL，取3種供試菌(大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌)0.1 mL 均勻涂布到直徑為100 mm 的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，用無菌鑷子夾取烘干的濾紙片貼在含菌培養(yǎng)基表面，并輕輕按壓使充分接觸，每皿等距離放4 片，并再放入一個(gè)浸生理鹽水的紙片作為空白對(duì)照，每個(gè)試驗(yàn)平行5 次，置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 ～24 h 后培養(yǎng)觀察并測(cè)定抑菌圈直徑大小，取平均值。結(jié)果為5 次平行試驗(yàn)的平均值，取兩位有效數(shù)字。同樣方法分別進(jìn)行50%、60%、70%、80%提取液的藥敏紙片法測(cè)抑菌圈試驗(yàn)操作，計(jì)算出抑菌圈的直徑并取平均值。將所得的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析比較，從而得出最佳抑菌效果的茜草提取液以進(jìn)行下面的試驗(yàn)操作。

1.5.4 最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定［9］

在特殊條件下培養(yǎng)24 h，可抑制某種微生物出現(xiàn)明顯增長(zhǎng)的最低藥物濃度即最小抑菌濃度。將具有最佳抑菌效果的提取原液(1 g/mL)用無菌水按照1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64 的體積比進(jìn)行倍半稀釋，得到6 個(gè)濃度的稀釋提取液，加之原液一共有7 個(gè)濃度梯度的提取液，并且分為基部根、粗根、細(xì)根3 種。在無菌培養(yǎng)皿中分別加入1.5 mL 不同濃度和不同種類的茜草提取液，然后倒入20 mL 的55 ℃左右滅菌的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基充分混勻，冷卻凝固。分別取0.1 mL 的供試菌懸液，并分別加入到70 mL的無菌生理鹽水中混勻，制成濃度106個(gè)/mL 左右的菌懸液。取0.1 mL 的稀釋菌懸液于平板上涂布均勻，每一系列培養(yǎng)基接種一種菌，每個(gè)濃度做3 個(gè)重復(fù)，以未添加提取液的系列培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，然后置于37 ℃下培養(yǎng)24 h 后觀察。無菌生長(zhǎng)的最低濃度即為提取物的MIC。

2 結(jié)果與分析

2.1 茜草根不同提取物的抑菌效果比較

表1 為茜草根不同部位的提取液對(duì)3 種菌的抑菌圈直徑，由表1 可知:水的提取液對(duì)3 種供試菌的抑菌效果不明顯，而用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇提取的茜草液(濃度為0.5 g/mL)抑菌效果較好。由表1 還可以看出:60%乙醇提取液對(duì)3 種菌均有相對(duì)較好的抑菌效果;從60%乙醇提取液的抑菌活性向兩側(cè)整體呈減小趨勢(shì)。為了驗(yàn)證這一結(jié)論，又多次重復(fù)50%和70%乙醇提取液的抑菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果沒有顯著差異。60%乙醇茜草基部根提取液對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑分別為7.80 mm、8.78 mm、7.88 mm。60%乙醇茜草粗根提取液對(duì)3 種菌的抑菌圈直徑分別為7.65 mm、8.63 mm、7.58mm。60%乙醇茜草細(xì)根提取液對(duì)3 種菌的抑菌圈直徑分別為7. 08 mm、7. 80 mm、8.58mm。由50%、70%、80%乙醇提取液抑菌效果及上述結(jié)果表明:茜草根不同部位提取液總體上對(duì)金黃色葡萄球和枯草芽孢桿菌的抑菌效果要比大腸桿菌的效果好，特別是60%細(xì)根提取液對(duì)枯草芽孢桿菌抑菌效果要比基部根和粗根明顯。

表1 茜草根不同部位的提取液對(duì)3 種菌的抑菌圈直徑

表2 為不同提取液抑菌效果差異顯著性分析。由表2 可知:60%提取液與50%、70%、80%及水提取液均有極顯著差異，60%乙醇提取液抑菌效果最好，所以在MIC 的確定中，使用60%乙醇提取液。

表2 不同提取液抑菌效果差異顯著性分析

對(duì)于不同菌種的抑菌活性差異見表3。由表3 看出:茜草根提取液對(duì)大腸桿菌抑菌效果較差，而對(duì)于枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌來說，其效果有顯著差異。

表3 不同菌種抑菌活性的差異顯著性

2.2 茜草根不同提取物對(duì)3 種供試菌的MIC 的測(cè)定和比較

表4 為不同茜草根60%乙醇提取液MIC。由表4 可知:對(duì)照組有大量的菌生長(zhǎng)，說明待測(cè)物的抗菌活性來自于其本身。茜草基部根提取液對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的最低抑菌濃度分別為0.250 g/mL、0.125 g/mL、0.125 g/mL;茜草粗根提取液對(duì)3 種供試菌的最低抑菌濃度分別為0.250 g/mL、0.125 g/mL、0.125 g/mL;茜草細(xì)根提取液對(duì)3 種菌的最低抑菌濃度分別為0.500 g/mL、0.250 g/mL、0.125 g/mL。說明茜草的基部根、粗根、細(xì)根提取液對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑菌效果優(yōu)于大腸桿菌。

表4 不同茜草根60%乙醇提取液MIC g/mL

3 討論

茜草根不同部位的抑菌活性有顯著差異，以基部根效果最好，說明其藥效也是最好的，基部根正處于根和莖連接處，抑菌物質(zhì)合成與運(yùn)輸都要通過此處，故其有效成分含量較高，抑菌效果最好。而細(xì)根由于處于快速生長(zhǎng)期，其抑菌物質(zhì)的積累較少，故抑菌效果較差。

茜草抑菌物質(zhì)的提取時(shí)間和提取溫度也會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果，在提取過程中抑菌物質(zhì)會(huì)有一定的損失，在一定程度上也會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果。不同地域的茜草根含有的抑菌物質(zhì)的含量也不盡相同，需要進(jìn)一步地對(duì)本地產(chǎn)茜草的抑菌物質(zhì)進(jìn)行分析，以得出抑菌物質(zhì)的成分，將有利于人們利用茜草，發(fā)揮其作用。

［1］ 侯寬昭.中國(guó)種子植物科屬詞典［M］.北京:科學(xué)出版社，1982:422.

［2］ 羅獻(xiàn)瑞.中國(guó)茜草科資料(五)［J］.熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)，1999，7(1):l5.

［3］ 藥典編委會(huì).中華人民共和國(guó)藥典:第一部［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2005.

［4］ 方曉艷，孫艷紅，楊林莎.茜草的研究進(jìn)展［J］.河南中醫(yī)藥學(xué)刊，2002，17(5):78－80.

［5］ 張振英，黃顯峰.茜草的藥理作用研究進(jìn)展［J］.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2007，17(5):58－60.

［6］ 宋立人，洪恂，丁緒亮，等.現(xiàn)代中藥學(xué)大辭典［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2001:1463－1466.

［7］ 沈萍，范秀容，李廣武.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)［M］.3 版.北京:高等教育出版社，1999:214－215.

［8］ 譚朝陽，尤昭玲.茜草提取工藝的研究［J］.中草藥，2004，35(4):399－401.

［9］ 周蓮杰，賀轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)，古麗斯瑪依·艾拜都拉，等.新疆部分特色林果果殼的抗菌活性研究［J］.生物技術(shù)通訊，2010，21(6):855－856，860.