錢小成 李曉飛 劉正亮 潘紅春

（安徽師范大學生命科學學院，重要生物資源保護與利用研究安徽省重點實驗室，生物環(huán)境與生態(tài)安全安徽省高校省級重點實驗室，蕪湖 241000）

淡水水螅是常見的兩胚層低等動物，由于其具備在實驗室易培養(yǎng)以及無性繁殖速度非常快等優(yōu)點，因此水螅已成為在進化生物學、細胞生物學、發(fā)育生物學和動物再生等研究領域具有較高科研價值的模式生物［1，2］。水螅具有簡單的單個體軸的極性體制，一個極為由口、垂唇和口周圍的數(shù)根觸手組成的口區(qū)，另一極為由柄和位于身體末端的基盤構成的足區(qū)，口區(qū)和足區(qū)之間為胃區(qū)，其中胃區(qū)與柄的分界處為出芽區(qū)。在野外自然水體中，水螅依靠基盤吸附于水中物體如水生植物的表面，其身體另外一端即水螅頭部口周圍的觸手得以自然延長下垂“守株待兔”式地捕食水中快速運動的小型無脊椎動物，因此位于身體末端的基盤作為固著器官在水螅生命活動中發(fā)揮著重要的作用［3，4］。基盤組織的形態(tài)學、細胞組成及相關生理生化指標已較為明確［5－9］，但基盤的固著機理及保持基盤組織的形態(tài)學完整性（基盤在附著和脫離水中支持物表面的過程中形態(tài)結構易受到破壞）的細胞學機制等方面仍未定論。

本研究室由于實驗需要經(jīng)常在高頻喂食的條件下規(guī)?；囵B(yǎng)水螅，在大批量水螅個體中偶然發(fā)現(xiàn)一些水螅個體出現(xiàn)更新基盤組織的現(xiàn)象，這個現(xiàn)象暗示水螅的營養(yǎng)積累可能是水?；P組織更新的誘因?；诖耍疚臑樘接懰I養(yǎng)積累與基盤組織更新進程間的相關性，系統(tǒng)地觀察了不同喂食頻率條件下水螅更新基盤組織的進程，為進一步研究水螅基盤保持形態(tài)學完整性的細胞學機制提供基礎資料。

材料和方法

1.實驗材料

實驗用水螅為本實驗室培育的大乳頭水螅（Hydramagnipapillata）單克隆無性繁殖系，原種采自安徽省蕪湖市汀堂公園水塘（31。21’39.2”N，118。22’51.46”E）。實驗前水螅每3d喂食一次鹵蟲幼體（Artemia sp.），喂食1h后更換培養(yǎng)液，然后維持在溫度22±0.5℃的光照培養(yǎng)箱中（光照強度＝2000LX，LD：HD＝12h∶12h）。

2.實驗方法

2.1 喂食頻率與基盤更新進程相關性實驗

挑取體長1.5cm左右且無芽體的水螅個體用于本實驗。共分為5個實驗組，每組的喂食頻率分別為1天喂1次、1天喂2次、1天喂3次、1天喂4次和1天喂5次。所有實驗在溫度22±0.5℃、光照度2000LX以及光周期亮暗比12h∶12h的條件下進行，每個實驗組20只水螅，每只水螅單獨放在0.5L玻璃燒杯中培養(yǎng)，此后每隔24h通過Olympus數(shù)碼顯微鏡觀察和記錄。每次喂食后均清污換水，所用水為除氯曝氣并充氧的自來水。實驗共進行了40d。

2.2 基盤分子標志物基盤過氧化物酶表達的檢測

通過ABTS細胞化學染色法檢測水螅基盤分子標志物過氧化物酶的表達，觀察水螅基盤組織是否形成。ABTS細胞化學染色法的基本原理是反應液中的ABTS和H2O2均能一定程度地穿透細胞膜進入細胞質，在細胞質中表達的過氧化物酶可使H2O2分解為水和活性氧，而活性氧進一步氧化ABTS使之由還原態(tài)時的淡藍色轉變?yōu)檠趸瘧B(tài)時的紫紅色，就這樣表達過氧化物酶的細胞被染成紫紅色［2－3］。將水螅置于白色陶瓷比色板上（每孔1只水螅），每孔分別加入350μl新鮮配制的ABTS染色混合液（655mmol/L檸檬酸、345mmol/L檸檬酸鹽和1%ABTS溶液各700μl，70μl 0.3%H2O2，雙蒸水定容至7ml）［4］，反應20min后用雙蒸水洗滌2次，加入300μl 2%NaF溶液，然后通過Olympus數(shù)碼顯微鏡觀察和拍照。

結 果

1.水螅更新基盤組織進程中的形態(tài)學變化

不同喂食頻率下水螅更新基盤組織的時間進程雖有差異，但其形態(tài)學進程卻類似（圖1）。維持一定的喂食頻率一段時間后，水螅在出芽區(qū)逐漸出現(xiàn)數(shù)個芽體（圖1B－C），成熟芽體不斷脫落，新生芽體不斷出現(xiàn)，若干天后在出芽區(qū)和基盤之間靠近芽體的位置出現(xiàn)縊痕（圖1D－F），最后水螅體在縊痕處斷裂為水螅體主體和老基盤組織兩部分（圖1G）。

圖1 1d喂3次實驗組水螅更新基盤組織進程中的形態(tài)學變化.1d（A，10×），3d（B，10×），5d（C，10×），14d（D，10×），21d（E，10×），縊痕斷裂前基盤過氧化物酶的表達（F，30×），23d時縊痕斷裂（G，6×），縊痕斷裂12h后的老基盤組織（H，15×），縊痕斷裂48h后的老基盤組織（I，10×），縊痕斷裂72h后的老基盤組織（J，10×），縊痕斷裂3d后水螅體主體（K，10×），縊痕斷裂15d后水螅體主體（L，10×），縊痕斷裂15d后水螅體主體傷口處過氧化物酶表達的檢測（M，20×），BBP（芽體基盤組織過氧化物酶的表達），BD（基盤），BR（出芽區(qū)），BU（芽體），CO（縊痕），M（口），OBD（老基盤組織），OBP（老基盤組織過氧化物酶的表達），PP（水螅體主體），T（觸手），WO（縊痕斷裂后的傷口）Fig.1 The morphological process of hydra renewing basal disc under the feeding frequency of thrice daily.1d（A，10×），3d（B，10×），5d（C，10×），14d（D，10×），21d（E，10×），the expression of peroxidase in the basal disc before the hydra broke into two parts at the constriction（F，30×），the hydra broke into two parts at the constriction after 23days under the feeding frequency of thrice daily（G，6×），old basal disc tissue at 12hafter the hydra broke into two parts at the constriction（H，15×），old basal disc tissue at 48hafter the hydra broke into two parts at the constriction（I，10×），old basal disc tissue at 72hafter the hydra broke into two parts at the constriction（J，10×），the parent polyp at 3dafter the hydra broke into two parts at the constriction（K，10×），the parent polyp at 15dafter the hydra broke into two parts at the constriction（L，10×），the detection of peroxidase expression in the wound of parent polyp at 15dafter the hydra broke into two parts at the constriction（M，20×），BBP（the expression of peroxidase in the basal disc of bud），BD（basal disc），BR（budding region），BU（bud），CO（constriction），M （mouth），OBD（old basal disc tissue），OBP（the expression of peroxidase in the old basal disc tissue），PP（parent polyp），T（tentacle），WO（wound）

2.喂食頻率對基盤更新進程的影響

喂食頻率對水螅基盤更新進程的影響較為明顯（表1），實驗進行到40d時，1天喂5次、1天喂4次、1天喂3次和1天喂2次實驗組中的每個水螅個體在芽體下方均出現(xiàn)了縊痕，但1天喂1次實驗組僅有70%的個體在芽體下方出現(xiàn)縊痕。另外，實驗進行到40天時各實驗組縊痕最終斷裂的水螅個體數(shù)差異明顯，1天喂4次、1天喂3次和1天喂2次實驗組中70%以上的個體縊痕斷裂，1天喂5次實驗組50%的個體縊痕斷裂，而1天喂1次實驗組總共20只個體中只有3只縊痕斷裂。

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3.脫落的老基盤組織的兩種命運

實驗進行到40d時從所有實驗組得到的共約60只脫落的老基盤組織在縊痕斷裂后獨立發(fā)育時呈現(xiàn)兩種不同的命運，其中約1/3的老基盤組織的傷口再生出頭部、直至發(fā)育成正常的水螅個體（圖1H－J），其頭部再生時間進程與水螅頭部人工切除手術后頭部再生時間進程基本相似［2］；而另外約2/3的老基盤組織在縊痕斷裂后獨立發(fā)育時逐漸收縮和萎縮，其傷口處不能發(fā)育成頭部，直至1w后解體（圖2）。

4.老基盤組織脫落后水螅體主體新基盤組織的再生

縊痕斷裂后對水螅體主體保持既定的喂食頻率，其斷裂傷口能愈合但不能再生出新的基盤組織（圖1K－L），這個結論有兩個重要依據(jù)，其一是愈合的傷口處（該部位本應再生出新生基盤組織）一直無固著能力；其二是愈合的傷口處未能檢測出基盤特異性過氧化物酶（基盤分子標志物）的表達（圖1M）。喂食頻率降低到3天喂1次后，傷口上方的芽體逐漸脫落（圖3C－F），直至其傷口上方的芽體全部脫落后愈合的傷口處再生出新生基盤組織（圖3G－H）。

圖2 1天喂3次實驗組1例水螅個體更新基盤組織進程中的形態(tài)學變化.1d（A，10×），5d（B，15×），縊痕斷裂12h后的老基盤組織（C，20×），縊痕斷裂4d后的老基盤組織（D，20×），縊痕斷裂6d后的老基盤組織（E，20×），縊痕斷裂8d后的老基盤組織已分解（F，200×），CO（縊痕），PP（水螅體主體）Fig.2 The morphological process of hydra renewing basal disc under the feeding frequency of thrice daily.1d（A，10×），5d（B，15×），old basal disc tissue at 12hafter the hydra broke into two parts at the constriction（C，20×），old basal disc tissue at 4dafter the hydra broke into two parts at the constriction（D，20×），old basal disc tissue at 6dafter the hydra broke into two parts at the constriction（E，20×），old basal disc tissue at 8dafter the hydra broke into two parts at the constriction（F，200×），CO（constriction），PP（parent polyp）

圖3 縊痕斷裂后水螅體主體傷口處新基盤組織的再生.1天喂3次進行到16d（A，10×），1天喂3次進行到24d（B，10×），縊痕斷裂后降低喂食頻率（降低到3天喂1次）第2d水螅體主體（C，10×），縊痕斷裂后降低喂食頻率第3d水螅體主體（D，10×），縊痕斷裂后降低喂食頻率第4d水螅體主體（E，10×），縊痕斷裂后降低喂食頻率第6d水螅體主體（F，10×），縊痕斷裂后降低喂食頻率第6d水螅體主體再生的新基盤組織吸附在玻片表面的形態(tài)（G，300×），縊痕斷裂后降低喂食頻率第6d水螅體主體再生的新基盤組織過氧化物酶的表達（H，250×），BD（基盤），CO（縊痕），CZ（不與玻片表面接觸的基盤中央?yún)^(qū)域），NBP（新基盤組織過氧化物酶的表達），OBD（老基盤組織），PP（水螅體主體），PS（基盤組織周邊區(qū)域伸出的偽足），PZ（基盤組織固著于玻片表面的周邊區(qū)域），WO（縊痕斷裂后的傷口）Fig.3 New basal disc regeneration of parent polyp after the hydra broke into two parts at the constriction.16dunder the feeding frequency of thrice daily（A，10×），24dunder the feeding frequency of thrice daily（B，10×），2dunder the lower feeding frequency of once every three days（C，10×），3dunder the lower feeding frequency of once every three days（D，10×），4dunder the lower feeding frequency of once every three days（E，10×），6dunder the lower feeding frequency of once every three days（F，10×），new basal disc attaching to glass slide（G，300×），the expression of peroxidase in the new basal disc of parent polyp（H，250×），BD（basal disc），CO（constriction），CZ（central zone of new basal disc），NBP（the expression of peroxidase in the new basal disc of parent polyp），OBD（old basal disc），PP（parent polyp），PS（pseudopod），PZ（perimeter zone of new basal disc），WO（wound）

討 論

研究發(fā)現(xiàn)的淡水水螅更新基盤組織的特殊現(xiàn)象以前在刺胞動物門水螅綱動物中未見報道，其生物學意義值得深入探討［10］。從水螅體本體脫落的老基盤組織的兩種不同的命運（大部分的老基盤組織不能發(fā)育成正常水螅體、最終解體；而小部分的老基盤組織能發(fā)育成正常水螅體）折射出水螅更新基盤組織的生物學意義可能是多元的。在自然水體中水螅憑借其基盤附著在水中的植物或其他物體的表面，同時基盤表面上皮細胞還可伸出偽足而使身體沿著支持物慢慢移動，有時基盤也可脫離原來的支持物、進而轉移到其他支持物上［4］。水?；P在附著、脫離支持物的過程中其細胞結構容易受到損傷，這可能是水螅更新基盤組織的內在動因。

然而，實驗結果表明，也有一部分從水螅體本體脫落的老基盤組織正常發(fā)育成新生水螅，似乎水螅更新基盤的現(xiàn)象是一種無性生殖形式，特別是水螅斷裂前在出芽區(qū)和基盤之間靠近芽體位置出現(xiàn)的縊痕（圖1D－F）提示這種更新基盤的過程是一種無性橫裂生殖。較低喂食頻率（1天喂1次）實驗組縊痕最終斷裂的水螅個體數(shù)量很少、而其他實驗組（1天喂2－5次）縊痕最終斷裂的水螅個體數(shù)量較多（表1），喂食頻率其實代表水螅營養(yǎng)積累水平［11］，因此本文實驗結果實際上反映的是較高營養(yǎng)積累水平能促進水螅更新基盤組織。較高營養(yǎng)水平首先促進水螅出芽生殖（圖1C，圖3A），在出芽區(qū)下方縊痕產(chǎn)生之前出芽區(qū)一直保持數(shù)個芽體（存在的芽體是動態(tài)的，成熟芽體不斷脫落，新生芽體不斷出現(xiàn)），這種高頻率的無性出芽生殖持續(xù)一段時間后在出芽區(qū)下方開始出現(xiàn)縊痕。水螅個體大小是一定的，高營養(yǎng)積累水平刺激細胞分裂，最終以出芽生殖的形式保持水螅體內營養(yǎng)平衡，因此高頻率的無性出芽生殖維持相當長時間后在出芽區(qū)和基盤之間靠近芽體的位置橫斷為前、后兩個部分（水螅體本體及老基盤組織）可能是水螅在較高喂食頻率下保持體內營養(yǎng)平衡的另外一種補充方式。總之，本文首次觀察到的淡水水螅在出芽區(qū)和基盤之間的橫斷現(xiàn)象可以歸納為除出芽生殖外的第二種無性生殖方式，并且較高營養(yǎng)積累水平能刺激這種無性橫裂生殖的發(fā)生。

另外，研究還發(fā)現(xiàn)縊痕斷裂后對水螅體主體保持既定的喂食頻率，其斷裂傷口能愈合但不能再生出新的基盤組織；對其降低喂食頻率直至其傷口上方的芽體全部脫落后斷裂傷口處才開始啟動產(chǎn)生新的基盤組織，這說明傷口附近的芽體抑制了該處新生基盤的再生。無獨有偶，金燦等通過人工手術在水螅芽體下方緊貼芽體的位置把水螅切割為前后兩個部分［12］，手術后身體前段傷口處不能馬上啟動基盤再生機制，即使芽體脫離母體后仍然有相當數(shù)量的身體前段傷口不能再生出新生基盤。芽體抑制傷口處基盤組織再生的機制值得進一步探討。

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