余君彤， 楊蕎嘉， 鄢思斯， 馬三梅， 王永飛

(暨南大學(xué)生物工程學(xué)系，廣東 廣州 510632)

氣孔是植物體與外界環(huán)境進(jìn)行氣體交換的通道，它通常由2個(gè)保衛(wèi)細(xì)胞圍繞而成.保衛(wèi)細(xì)胞對(duì)外部環(huán)境非常敏感，強(qiáng)光、高溫、干旱和一定量的外源水楊酸、脫落酸、乙烯、H2O2、赤霉素和NO等物質(zhì)均能誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉.植物體的光合作用、呼吸作用、水分代謝以及免疫反應(yīng)［1］等都與氣孔運(yùn)動(dòng)密切相關(guān).前人關(guān)于氣孔運(yùn)動(dòng)的研究主要集中在植物的葉片，但目前已經(jīng)在植物的非光合器官如花冠［2-3］、果實(shí)［4-5］、種子［6］、初生根［7］、蜜腺［8-9］等部位的表皮發(fā)現(xiàn)有氣孔存在.這些發(fā)現(xiàn)拓寬了氣孔的分布范圍，為研究氣孔運(yùn)動(dòng)提供新材料.

蔥蓮(Zephyranthes candida)別名蔥蘭、玉簾、白花菖蒲，石蒜科(Amaryllidaceae)蔥蓮屬(Zephyranthes Herb)的多年生草本植物.地下具鱗莖，線形葉，花單生于花莖頂端，蒴果近球形，3瓣開(kāi)裂，種子黑色，扁平.我們前期的研究表明蔥蓮果皮上有氣孔分布［10］.雖然前人已經(jīng)對(duì)果皮上氣孔分布進(jìn)行大量研究，但關(guān)于果實(shí)上氣孔運(yùn)動(dòng)的研究尚未見(jiàn)報(bào)道.這些氣孔的開(kāi)關(guān)機(jī)制如何，NO和水楊酸能否影響這些氣孔的開(kāi)關(guān)，對(duì)這些問(wèn)題，目前還沒(méi)有明確的答案.

本試驗(yàn)用不同濃度的NO供體硝普鈉(sodium nitroprusside，SNP)和水楊酸(salicylic acid，SA)分別對(duì)蔥蓮?fù)夤みM(jìn)行處理，觀察氣孔孔徑的變化，以探討NO和SA對(duì)蔥蓮?fù)夤饪钻P(guān)閉的單獨(dú)影響，并結(jié)合NO清除劑血紅蛋白(hemoglobin，Hb)和硝酸還原酶(nitrate reductase，NR)抑制劑疊氮化鈉(sodium azide，NaN3)對(duì)NO和SA的相互關(guān)系進(jìn)行分析，為深入了解蔥蓮果實(shí)上氣孔的功能以及在調(diào)控蔥蓮果實(shí)氣孔運(yùn)動(dòng)過(guò)程中NO與SA的相互關(guān)系和作用機(jī)制奠定基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 植物材料

實(shí)驗(yàn)材料是暨南大學(xué)校園內(nèi)人工栽培的蔥蓮(Zephyranthes candida(Lindl.)Herb).采集直徑為1.4 cm左右的果實(shí)，對(duì)其外果皮進(jìn)行研究.

1.2 NO和SA處理

將蔥蓮的果實(shí)先用蒸餾水洗凈，撕取外果皮，用毛筆小心刷除黏附的葉肉細(xì)胞，放入盛有表皮條緩沖液(10 mmol·L-1Mes/KOH，50 mmol·L-1KCl，100 μmol·L-1CaCl2，pH 6.20)的培養(yǎng)皿中，置于25 ℃和可見(jiàn)光(PAR 300 μmol·m-2·s-1)下處理3 h以促使氣孔處于開(kāi)放狀態(tài).每個(gè)實(shí)驗(yàn)處理觀察10個(gè)表皮條，重復(fù)3次.

(1)單獨(dú)處理 研究單獨(dú)的NO和SA對(duì)光下氣孔運(yùn)動(dòng)的影響時(shí)，將光下處理3 h的表皮條轉(zhuǎn)移到含有不同濃度 NO(1、10、100 和1000 μmol·L-1)或 SA(1、10、100 和 1 000 μmol·L-1)的 MES 緩沖液內(nèi)，繼續(xù)處理3 h，測(cè)量氣孔孔徑.

(2)共處理 研究NO和SA對(duì)光下氣孔運(yùn)動(dòng)的相互關(guān)系時(shí)，將可見(jiàn)光下處理3 h的表皮條分別轉(zhuǎn)移到以下3種含有不同物質(zhì)的MES緩沖液內(nèi):(Ⅰ)100 μmol·L-1NO;(Ⅱ)100 μmol·L-1SA;(Ⅲ)100 μmol·L-1NO 和 100 μmol·L-1SA.在 25℃可見(jiàn)光下培養(yǎng)3 h后，測(cè)量表皮條氣孔孔徑并拍照記錄.

研究清除NO后，SA對(duì)蔥蓮?fù)夤饪走\(yùn)動(dòng)的影響時(shí)，將可見(jiàn)光下處理3 h的表皮條分別轉(zhuǎn)移到以下含有不同物質(zhì)的MES緩沖液內(nèi):

(Ⅰ)質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%Hb;

(Ⅱ)100 μmol·L-1NaN3;

(Ⅲ)100 μmol·L-1SA;

(Ⅳ)質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%Hb和100 μmol·L-1SA;

(Ⅴ)100 μmol·L-1NaN3和 100 μmol·L-1SA.

在25℃可見(jiàn)光下培養(yǎng)3 h后，測(cè)量表皮條氣孔孔徑并拍照記錄.

1.3 氣孔孔徑的測(cè)定

用Nikon YS100顯微鏡，在40倍物鏡下，每個(gè)處理測(cè)量80個(gè)氣孔的孔徑，取平均值.

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理和相關(guān)分析用SPSS 13.0和Excel 2003軟件完成.

2 結(jié)果

2.1 NO對(duì)蔥蓮?fù)夤ど蠚饪钻P(guān)閉的影響

在1 ～1 000 μmol·L-1濃度范圍內(nèi)，NO 可顯著誘導(dǎo)蔥蓮?fù)夤さ臍饪钻P(guān)閉(P＜0.05)，且具有明顯的濃度效應(yīng)，隨著NO濃度的升高，其誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉的作用更加明顯(圖1).加入NO 3 h后，NO濃度為 1、10、100 和 1 000 μmol·L-1的蔥蓮的花冠下表皮氣孔孔徑分別比 0 μmol·L-1時(shí)減小 18.7%、23.2%、28.8%和 34.4%.

圖1 不同濃度NO對(duì)蔥蓮?fù)夤ど蠚饪钻P(guān)閉的影響Fig.1 Effect of NO on the stomatal closure on the epicarp of Z.candida with different concentrations

2.2 SA對(duì)蔥蓮?fù)夤ど蠚饪钻P(guān)閉的影響

圖 2 顯示，在1 ～1 000 μmol·L-1濃度范圍內(nèi)，SA可顯著誘導(dǎo)蔥蓮?fù)夤さ臍饪钻P(guān)閉(P＜0.05)，且也具有明顯的濃度效應(yīng)，SA濃度越高，氣孔孔徑越小，誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉的作用越明顯.加入SA 3 h后，SA 濃度為 1、10、100 和 1 000 μmol·L-1的蔥蓮?fù)夤饪卓讖椒謩e比0 μmol·L-1時(shí)減小19.1%、23.3%、30.6%和 42.7%.

圖2 不同濃度SA對(duì)蔥蓮?fù)夤ど蠚饪钻P(guān)閉的影響Fig.2 Effect of SA on the stomatal closure on the epicarp of Z.candida with different concentrations

2.3 NO和SA在誘導(dǎo)蔥蓮?fù)夤ど蠚饪钻P(guān)閉中的關(guān)系

如圖3 所示，處理3 h 后，100 μmol·L-1NO 和100 μmol·L-1SA均顯著促進(jìn)氣孔關(guān)閉(P＜0.05)，用這兩者共同處理蔥蓮?fù)夤r(shí)，其誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉的效應(yīng)進(jìn)一步增強(qiáng)(P＜0.05).單獨(dú)的100 μmol·L-1NO和SA處理下的氣孔孔徑分別比對(duì)照減小29.7%和31.1%，兩者共處理時(shí)，氣孔孔徑比對(duì)照減小53.4%.

圖3 NO和SA在誘導(dǎo)蔥蓮?fù)夤ど蠚饪钻P(guān)閉中的關(guān)系Fig.3 Relation of NO and SA on the stomatal closure on the epicarp of Z.candida

2.4 清除NO對(duì)SA誘導(dǎo)蔥蓮?fù)夤ど蠚饪钻P(guān)閉作用的影響

圖4顯示，NO的清除劑Hb本身可使氣孔孔徑比對(duì)照略微減小(P＞0.05)，當(dāng) SA和 Hb共處理時(shí)，氣孔孔徑比單獨(dú)的SA處理時(shí)顯著增大(P＜0.05);同樣NR的抑制劑NaN3本身也可使氣孔孔徑略微減小(P＞0.05)，在 SA處理的同時(shí)加入NaN3也可降低SA誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉的效應(yīng).

圖4 Hb和NaN3對(duì)SA誘導(dǎo)蔥蓮?fù)夤ど蠚饪钻P(guān)閉的影響Fig.4 Effect of Hb and NaN3on SA-induced stomatal closure on the epicarp of Z.candida

3 討論

NO和SA是廣泛存在于植物體內(nèi)的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì).NO是一種具有水溶性和脂溶性的氣體小分子，作為植物體內(nèi)重要的信號(hào)分子，能夠調(diào)節(jié)植物體的氣孔運(yùn)動(dòng)、種子萌發(fā)、生長(zhǎng)發(fā)育、防御反應(yīng)、基因表達(dá)和細(xì)胞凋亡等生理過(guò)程［11-13］.NO常溫下不穩(wěn)定，通常用SNP作為NO的外源供體［12］.在植物細(xì)胞中主要通過(guò)兩種途徑合成NO，硝酸還原酶(nitrate reductase，NR)途徑和一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)途徑［14］.外源 NO 可以誘導(dǎo)蠶豆、豌豆、紫色鴨跖草、擬南芥、番茄、大麥和小麥的氣孔關(guān)閉，并且具有濃度效應(yīng)和時(shí)間效應(yīng).SA是植物體內(nèi)普遍存在的一種酚類(lèi)化合物，在植物體內(nèi)有多種生理調(diào)節(jié)作用，如促進(jìn)乙烯的生物合成，調(diào)節(jié)植物的光周期，影響黃瓜的性別分化，影響植物的抗病性，誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉等.Chen等［15］的研究表明SA的作用機(jī)制可能部分與H2O2有關(guān).王曉黎等［16］發(fā)現(xiàn)黃瓜子葉表皮氣孔開(kāi)度對(duì)SA的響應(yīng)表現(xiàn)出濃度效應(yīng)和時(shí)間效應(yīng).NO和SA對(duì)蔥蓮果實(shí)上氣孔運(yùn)動(dòng)的影響經(jīng)過(guò)本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，1～1 000 μmol·L-1NO和SA均能促進(jìn)蔥蓮果實(shí)上的氣孔關(guān)閉(圖1，2).

NO和SA在植物體內(nèi)的一些生理反應(yīng)上存在相互關(guān)系.NO和SA都能增強(qiáng)植物體的防御反應(yīng)［17］.NO可通過(guò)復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)激活苯丙氨酸解氨酶合成SA［18］;SA能通過(guò)改變順烏頭酸酶、過(guò)氧化物酶和過(guò)氧化氫酶來(lái)參與NO的生理效應(yīng)［17］.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NO和SA共同處理蔥蓮?fù)夤r(shí)，其誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉的效應(yīng)明顯大于NO或SA的單獨(dú)處理(P＜0.05).NO和SA在誘導(dǎo)蔥蓮果實(shí)上氣孔關(guān)閉過(guò)程中，具有協(xié)同效應(yīng)，NO和SA的信號(hào)交叉也可能存在于蔥蓮果實(shí)(圖3).

為了進(jìn)一步了解NO和SA在調(diào)控氣孔運(yùn)動(dòng)過(guò)程中的相互關(guān)系，我們又測(cè)定了NO的清除劑和NR抑制劑對(duì)SA調(diào)控蔥蓮?fù)夤ど蠚饪走\(yùn)動(dòng)的影響.結(jié)果表明，NO的清除劑和NR抑制劑可明顯降低SA誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉效應(yīng)(圖4).NO參與了SA誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉，并且SA可能是通過(guò)激活植物體內(nèi)的NR途徑產(chǎn)生NO.而NO和SA在蔥蓮果實(shí)內(nèi)誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉的確切機(jī)制還有待進(jìn)一步研究.

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