陳曉婷,劉海金,劉奕,周丹,韓英

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,黑龍江哈爾濱150030;2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院,北京100039;3.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院北戴河中心試驗站,河北秦皇島066100)

牙鲆第10腹椎骨與微衛(wèi)星標(biāo)記的相關(guān)性分析

陳曉婷1,劉海金2、3,劉奕1,周丹1,韓英1

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,黑龍江哈爾濱150030;2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院,北京100039;3.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院北戴河中心試驗站,河北秦皇島066100)

利用94對微衛(wèi)星標(biāo)記,對52尾雙單倍體牙鲆Paralichthys olivaceus第10腹椎骨的長度和高度與微衛(wèi)星標(biāo)記的相關(guān)性進(jìn)行分析。結(jié)果表明:微衛(wèi)星標(biāo)記Poli1222TUF、Poli1418TUF、Po1、Po91、Poli1498TUF、Poli11795TUF與第10腹椎骨長顯著相關(guān) (P＜0.05);Poli1406TUF與第10腹椎骨高顯著相關(guān) (P＜0.05); Poli1143TUF、Poli1356TUF和Poli1388TUF則與第10腹椎骨長和骨高均顯著或極顯著相關(guān) (P＜0.05或P＜0.01)。研究表明,這些標(biāo)記可以作為牙鲆輔助育種的參考。

牙鲆;雌核發(fā)育;雙單倍體;微衛(wèi)星標(biāo)記;腹椎骨

牙鲆Paralichthys olivaceus俗稱牙片、偏口、比目魚,是分布于中國沿海的大型經(jīng)濟(jì)魚類,其個體碩大、生長快速、肉質(zhì)細(xì)嫩鮮美,具有很高的經(jīng)濟(jì)價值。由于近年來的過度捕撈和環(huán)境污染,牙鲆自然資源大幅度下降,為了滿足市場需求,人們開始了大規(guī)模的人工養(yǎng)殖牙鲆。隨著累代養(yǎng)殖,近親繁殖和性狀衰退現(xiàn)象明顯,因此,選育優(yōu)良性狀的牙鲆,對其養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展具有重要意義[1]。

人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育是快速建立純系的有效手段。通過抑制第一次卵裂可以獲得有絲分裂雌核發(fā)育二倍體,即雙單倍體 (double haploid,DH)。同一母本的DH子代都是純合體,但后代個體之間基因型互不相同,是進(jìn)行遺傳連鎖分析的好材料[2-3]。微衛(wèi)星又稱為短串聯(lián)重復(fù)序列 (simple tandem repeats,STR)或簡單重復(fù)序列 (simple sequence repeat,SSR),具有串聯(lián)重復(fù)單元的重復(fù)次數(shù)在個體間變異性高、數(shù)量豐富、穩(wěn)定性好、多態(tài)性高、呈共顯性遺傳和遵循孟德爾分離定律等特點[4],微衛(wèi)星標(biāo)記作為分析重要經(jīng)濟(jì)性狀遺傳連鎖關(guān)系的理想標(biāo)記,現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)動物的遺傳圖譜構(gòu)建[5-6]、遺傳多樣性分析[7-8]、群體遺傳結(jié)構(gòu)分析[9-10]、 基因定位[11-12]、 QTL分析[13]等。

骨骼的生長受遺傳因素的影響較大,受外環(huán)境影響較小[14-15]。所以尋找骨骼參數(shù)與經(jīng)濟(jì)性狀緊密相關(guān)的標(biāo)記將會更準(zhǔn)確、更穩(wěn)定。牙鲆體長主要由頭骨、脊椎骨和尾骨組成,體高由脊椎骨高和肋骨長組成。牙鲆的脊椎骨由腹椎骨和軀椎骨組成,第10腹椎骨為腹椎骨的最后一塊,也是所有脊椎骨中較大的一塊,因此是脊椎骨中的重要骨骼。本研究中,作者以DH牙鲆第10腹椎骨的骨長和骨高為研究對象,分析微衛(wèi)星位點與其相關(guān)性,篩選出與這些性狀相關(guān)的分子標(biāo)記,旨在為牙鲆經(jīng)濟(jì)性狀的QTL定位及分子標(biāo)記輔助育種提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗魚 采用中國水產(chǎn)科學(xué)研究院北戴河中心試驗站選育的野生牙鲆親魚為試驗材料。采用王凱等[16]誘導(dǎo)雌核發(fā)育的方法,用紫外線滅活的真鯛Pagrosomus major精子與牙鲆雌魚的同一批卵混合,靜置3 min后,加入17℃的海水激活牙鲆雌魚卵,1 h后轉(zhuǎn)移到靜水壓力機(jī) (5406R,大岳,日本制)中,施壓650 MPa,抑制卵裂,6 min后移至海水 (17℃)中孵化。自2009年5月起,采用室內(nèi)水槽養(yǎng)殖方法進(jìn)行繁殖,于2010年11月采集52尾DH個體進(jìn)行表型和基因型分析。

1.1.2 引物與試劑 根據(jù)GeneBank庫中的牙鲆微衛(wèi)星序列設(shè)計并篩選出有效微衛(wèi)星引物94個。引物由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成;Taq DNA聚合酶、dNTPs等生化試劑以及DL2000 DNA Maker均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 性狀測量 使用電子天平稱量體質(zhì)量,精確到0.1 g;用X-射線機(jī) (LX-20A型,朗安公司產(chǎn)品)拍攝牙鲆骨骼的X光照片 (圖1)。用Motic Images Plus 2.0軟件測量照片上的魚體性狀,獲得第10腹椎骨長、骨高等性狀,精確到0.01 cm。第10腹椎骨長為該塊脊椎骨從牙鲆頭側(cè)到尾側(cè)的長度,骨高是與其長垂直的高度。

圖1 牙鲆X-射線圖Fig.1 The X-ray photography of Japanese flounder Paralichthys olivaceus

1.2.2 牙鲆基因組DNA的提取 利用牙鲆尾鰭組織提取基因組 DNA,將尾鰭剪碎,加入裂解液[50 mmol/L Tris-HCl,100 mmol/L NaCl,20 mmol/L EDTA(pH 8.0),200 mg/L的蛋白酶K, 1%SDS],使其在50℃條件下完全溶解,用相同體積的飽和酚、氯仿混合液抽提1次,再用等體積的異丙醇沉淀,然后用體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇清洗沉淀,待TE將沉淀溶解后,放入冰箱 (-20℃)中保存以備用。

1.2.3 PCR反應(yīng) 10 μL PCR反應(yīng)體系包含10× buffer 1 μL、dNTPs 0.6 μL、20 pmol/L上下游引物各0.3 μL、模板 DNA 0.4 μL、Taq DNA聚合酶0.04 μL,ddH2O 7.36 μL。PCR反應(yīng)程序:94℃下預(yù)變性5 min;94℃下變性30 s,50～65℃下退火30 s,72℃下延伸30 s,共進(jìn)行25個循環(huán);最后在72℃延伸10 min。

1.2.4 微衛(wèi)星分子標(biāo)記的檢測 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用8% 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測,使用1× TBE作為電泳緩沖液,在250 V電壓下,根據(jù)片段大小電泳3 h左右,電泳后將凝膠放入配制好的染色液 (0.5 g硝酸銀,500 mL蒸餾水)中銀染10 min,經(jīng)5～10 min的顯色液顯色,顯色液由5 mL HCHO、10 g NaOH、0.02 g NaCO3和500 mL蒸餾水配制而成。凝膠的染色及顯色均在搖床上進(jìn)行,使其顏色均勻,并將凝膠放入透明塑封袋保存。使用凝膠成像系統(tǒng)對凝膠進(jìn)行拍照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用PopGene 32軟件對各微衛(wèi)星基因座的等位基因數(shù) (Na)、有效等位基因數(shù) (Ne)、等位基因頻率 (allele frequency)、群體雜合度 (H)進(jìn)行統(tǒng)計。多態(tài)性信息含量 (PIC)通過PIC_Calc 0.6軟件計算得出。

使用SPSS 13.0軟件中GML程序?qū)﹄p單倍體牙鲆的體質(zhì)量、第10腹椎骨長和骨高等性狀與94個微衛(wèi)星位點的相關(guān)性進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 牙鲆性狀分布

測量性狀皆顯示出連續(xù)變異的特點,所以這些性狀都是典型的數(shù)量性狀。體質(zhì)量、第10腹椎的骨長和骨高等性狀的平均值、偏度、峰度、最小值、最大值以及P值見表1。

表1 體質(zhì)量、第10腹椎骨長和骨高的正態(tài)分布檢驗Tab.1 The Gaussian distribution in body weight,and the tenth vertebral length and height

2.2 微衛(wèi)星基因位點的統(tǒng)計信息

檢測94對微衛(wèi)星標(biāo)記,共獲得188個等位基因。平均Ne為1.878 3,平均H為0.469 2,平均PIC為0.355 8(表2)。

表2 群體在94個微衛(wèi)星標(biāo)記基因位點的統(tǒng)計信息Tab.2 Statistics information of 94 microsatellite genetic loci in the Japanese flounder population

續(xù)表2 群體在94個微衛(wèi)星標(biāo)記基因位點的統(tǒng)計信息Cont.Tab.2 Statistics information of 94 microsatellite genetic loci in the Japanese flounder population

2.3 第10腹椎骨長、骨高與體質(zhì)量的相關(guān)性分析

利用最小二乘法對第10腹椎的骨長、骨高與體質(zhì)量進(jìn)行連鎖顯著性檢驗,第10腹椎的骨長、骨高與體質(zhì)量的相關(guān)系數(shù)分別為0.836、0.871,相關(guān)系數(shù)均達(dá)極顯著水平 (P＜0.01)。

2.4 牙鲆微衛(wèi)星標(biāo)記與體質(zhì)量、第10腹椎骨長和骨高的相關(guān)性分析

利用最小二乘法,對微衛(wèi)星標(biāo)記與牙鲆體質(zhì)量、第10腹椎骨長和骨高進(jìn)行相關(guān)性檢驗,在94個微衛(wèi)星位點中,微衛(wèi)星標(biāo)記 Poli1222TUF、Poli1418TUF、Po1、Po91、Poli1498TUF、Poli11795-TUF與第10腹椎骨長顯著相關(guān) (P＜0.05);Poli1406TUF與第10腹椎骨高顯著相關(guān) (P＜0.05); Poli1143TUF與第10腹椎骨長和骨高均顯著相關(guān)(P＜0.05);Poli1356TUF和 Poli1388TUF與體質(zhì)量、第10腹椎骨長和骨高均顯著或極顯著相關(guān)(P＜0.05,P＜0.01)(表3)。

表3 10個微衛(wèi)星位點不同基因型體質(zhì)量、第10腹椎的骨長與骨高的平均值Tab.3 Means of body weight,and the tenth vertebral length and height in the 10 microsatellite loci

3 討論

雙單倍體牙鲆因其所有的基因都已純合固定,可直接應(yīng)用于目標(biāo)性狀各種基因組合的分離和固定,縮短育種年限[17]。DH群體可通過雌核發(fā)育方式獲得后代,而不改變其遺傳組成,可多年多點試驗,有效減少誤差,從而有利于QTL分析和數(shù)量性狀的選擇[18]。本研究中選擇的試驗材料為牙鲆雙單倍體群體,每一個體完全同質(zhì)純合,同一位點只有兩種等位基因,可以提高在分析標(biāo)記與性狀相關(guān)性時的準(zhǔn)確性。

動物骨骼受遺傳因素的影響較大,而受外環(huán)境的影響較小[14-15],骨骼參數(shù)是一種相對穩(wěn)定的指標(biāo)。牙鲆脊柱與肋骨共同起到支撐和承擔(dān)魚體質(zhì)量的作用。因此,魚體質(zhì)量的變化,與脊椎骨的大小關(guān)系密切。魚體質(zhì)量越大,脊柱所要承擔(dān)的重量越大,脊椎骨高和骨長就越大。魚類的脊柱由一連串的脊椎骨所組成,一般分為腹椎和尾椎。脊柱長是構(gòu)成牙鲆體長的重要組成部分,脊椎骨長與體長有密切聯(lián)系;魚體高度則由脊椎骨高和肋骨長組成,脊椎骨的長和高對于牙鲆的體長和體高均有重要影響。已有研究表明,牙鲆的體長、體高與體質(zhì)量顯著相關(guān)[16,19]。但迄今尚未見到脊椎骨與體質(zhì)量相關(guān)性的研究報道。牙鲆有腹椎骨10個[20],第10腹椎骨為牙鲆腹椎骨的最后一塊,根據(jù)魚體形狀、X光片觀察和骨骼力學(xué)的特征,以最小材料承擔(dān)最大負(fù)荷的特點[21],牙鲆頭側(cè)第1腹椎骨到第10腹椎骨,其大小呈逐漸增大趨勢,由第11腹椎骨,也就是第1個尾椎骨開始,有逐漸減小趨勢。因此,第10腹椎骨為整個脊柱中相對較大的一個,可以作為代表。本試驗結(jié)果表明,第10腹椎骨長、骨高與體質(zhì)量的相關(guān)系數(shù)分別為0.836和0.871,均呈極顯著相關(guān),表明第10腹椎骨長和骨高可以作為選育體質(zhì)量值的指標(biāo)之一。而找到與此性狀相關(guān)的微衛(wèi)星標(biāo)記,即可在牙鲆幼年時期通過分子手段檢測出第10腹椎骨長和骨高這兩種表型值大的個體,從而預(yù)測體質(zhì)量大的個體,達(dá)到標(biāo)記輔助選育的目的。

本研究結(jié)果表明,Poli1222TUF、Poli1418TUF、Po1、Po91、Poli1498TUF、Poli11795TUF等6個標(biāo)記與第10腹椎骨長顯著相關(guān);Poli1406TUF與第10腹椎骨高顯著相關(guān);Poli1143TUF與第10腹椎骨長、骨高顯著相關(guān);Poli1356TUF、Poli1388TUF與體質(zhì)量以及第10腹椎的骨長、骨高均顯著或極顯著相關(guān)。Poli1222TUF和 Poli11795TUF均位于11號連鎖群上[22],但是位置較遠(yuǎn),Po91和 Poli1143TUF均位于9號連鎖群上,且距離較近,說明這兩個基因可能共同影響脊椎骨長這個性狀, Poli1418TUF、 Po1、 Poli1498TUF、 Poli1406TUF、Poli1356TUF、Poli1388TUF等標(biāo)記分別位于4、17、22、20、23、5連鎖群上,呈分散趨勢[22]。達(dá)到顯著相關(guān)的標(biāo)記與性狀有的是一個標(biāo)記同幾個性狀相關(guān),有的是幾個標(biāo)記同一個性狀相關(guān),可能是一因多效,或者多因一效的現(xiàn)象。盡管這些標(biāo)記還需要進(jìn)一步的驗證,但其統(tǒng)計結(jié)果也可為今后分子標(biāo)記輔助育種提供重要參考。

[1] 石宇光,劉海金,劉永新.雌核發(fā)育牙鲆家系的生長比較和形態(tài)分析[J].大連海洋大學(xué)學(xué)報,2010,25(4):324-329.

[2] William P Y,Paul A W,Virginia H C,et al.A detailed linkage map of rainbow trout produced using doubled haploids[J].Genetics,1998,148(2):839-850.

[3] Sato T,Yokomizo S,Matsuda M,et al.Gene-centromere mapping of medaka sex chromosomes using triploid hybrids between Oryzias latipes and O.luzonensis[J].Genetica,2001,111(1/3):71-75.

[4] 盛巖,鄭蔚虹,裴克全.馬克平微衛(wèi)星標(biāo)記在種群生物學(xué)研究中的應(yīng)用[J].植物生態(tài)學(xué)報,2002,26:119-126.

[5] 孫效文,梁利群.鯉魚的遺傳連鎖圖譜(初報)[J].中國水產(chǎn)科學(xué),2000,7(1):1-5.

[6] Knapik E W,Goodman A,Ekker M,et al.A microsatellite genetic linkage map for zebrafish Danio rerio[J].Nature Genetics,1998, 18:338-343.

[7] 周莉,劉靜霞,桂建芳.應(yīng)用微衛(wèi)星標(biāo)記對雌核發(fā)育銀鯽的遺傳多樣性初探[J].動物學(xué)研究,2001,22(4):257-264.

[8] 孫效文,梁利群.斑馬魚SSLP標(biāo)記檢測鯉魚種間的遺傳多態(tài)性[J].中國水產(chǎn)科學(xué),2001,8(2):5-6.

[9] 池喜峰,賈智英,李池陶,等.荷包紅鯉與德國鏡鯉正反雜交組遺傳結(jié)構(gòu)的微衛(wèi)星分析[J].大連海洋大學(xué)學(xué)報,2010,25(5): 450-455.

[10] Brooker A L,Cook D,Bentzen P,et al.Organization of microsatellites differs between mammals and cold-water teleost fishes[J]. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences,1994,51(9): 1959-1966.

[11] Palti Y,Shirak A,Cnaani A,et al.Detection of genes with deleterious alleles in an inbred line of tilapia Oreochromis aureus[J]. Aquaculture,2002,206(3/4):151-164.

[12] Kocabas A M,Kucuktas H,Dunham R A,et al.Molecular characterization and differential expression of the myostatin gene in channel catfish Ictalurus punctatus[J].Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Gene Structure and Expression,2002,1575(1/3):99-107.

[13] 李文升,劉翠,張曉峰,等.鏡鯉體重的QTL定位[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué),2011,30(4):316-324.

[14] 王秋榮,畢建功,林利民,等.青石斑魚骨骼發(fā)育異常的形態(tài)特征[J].大連海洋大學(xué)學(xué)報,2012,27(5):417-421.

[15] 李九軍,李勤,賀永春,等.遺傳因素對同卵雙生子顱頜面部軟硬組織形態(tài)的影響研究[J].同濟(jì)大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版,2009, 30(3):70-73.

[16] 王凱,劉海金,劉永新,等.牙鲆形態(tài)性狀對體重的影響效果分析[J].上海海洋大學(xué)學(xué)報,2008,17(6):655-660.

[17] Foroughi-Wehr B,Wenzel G.Recurrent selection alternating with haploid steps—a rapid breeding procedure for combining agronomic traits in inbreeders[J].Theoretical and Applied Genetics,1990, 80(4):564-568.

[18] Komen H,Thorgaard G H.Androgenesis,gynogenesis and the production of clones in fishes:A review[J].Aquaculture,2007,269 (1):150-173.

[19] 王桂興,劉永新,孫效文,等.牙鲆微衛(wèi)星分子標(biāo)記與生長性狀的相關(guān)性分析[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2009,40(7):77-84.

[20] 李思中,王惠民.中國蝶形目魚類骨骼的研究Ⅱ:脊椎骨、肋骨、上肋骨及肌隔骨刺[J].動物學(xué)報,1987,33(3):267-276.

[21] 楊安峰,程紅,姚錦仙.脊椎動物比較解剖學(xué)[M].北京:北京大學(xué)出版社,2008:85.

[22] Castaňo-Sánchez C,Fuji K,Ozaki A,et al.A second generation genetic linkage map of Japanese flounder(Paralichthys olivaceus) [J].BMC Genomics,2010,11(1):554-564.

Correlation of the tenth vertebra with microsatellite DNA marks in Japanese flounder Paralichthys olivaceus

CHEN Xiao-ting1,LIU Hai-jin2,3,LIU Yi1,ZHOU Dan1,HAN Ying1
(1.Animal Science and Technology College,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;2.Chinese Academy of Fishery Sciences, Beijing 100039,China;3 Beidaihe Central Experiment Station,Chinese Academy of Fishery Sciences,Qinhuangdao 066100,China)

Ninety-four microsatellite markers were applied to analyze the correlation between the tenth vertebral length and height and microsatellite DNA marks in 52 doubled haploids of Japanese flounder Paralichthys olivaceus. Results showed that there was significant correlation between Poli1222TUF,Poli1418TUF,Po1,Po91,Poli1498TUF,and Poli11795TUF and the tenth vertebral length and that there was significant correlation between Poli1406TUF and the tenth vertebral height(P＜0.05).The significant and very significant correlation were observed between Poli1143TUF,Poli1356TUF and Poli1388TUF and the tenth vertebral length and height(P＜0.05,or P＜0.01),which can be used as a reference to assisted selection of Japanese flounder.

Paralichthys olivaceus;gynogenesis;double haploid;microsatellite marker;vertebra

S917.4

:A

2095-1388(2013)04-0367-06

2012-12-24

國家鲆鰈類產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系 (CARS-50-G2);公益性行業(yè)農(nóng)業(yè)科研專項 (200903046);國家 “863”計劃項目 (2012AA10A-408-5)

陳曉婷 (1987-),女,碩士研究生。E-mail:gudanxiaoxiong@126.com

韓英 (1963-),女,教授。E-mail:hanying_606@163.com