趙 霞，賈 苗，王 磊，曹廣春*，張澤華

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，沈陽 110161;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所農(nóng)業(yè)部生物防治重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，北京 100081)

東亞飛蝗Locusta migratoria manilensis，Meyen是重要的農(nóng)業(yè)害蟲之一，在國內(nèi)外分布比較廣泛(洪曉月和丁錦華，2007)。自2010年以來，隨著氣候的異常變化和生態(tài)環(huán)境的改變，蝗災(zāi)的發(fā)生比較頻繁，其中澳大利亞東南部、新疆伊犁河谷以及河南黃河沿岸等地遭受嚴(yán)重的蝗蟲災(zāi)害，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，大量用于蝗災(zāi)防治的有機(jī)磷殺蟲劑馬拉硫磷，具有殺蟲譜廣、低毒高效、殘效期短、價格低廉等特點(diǎn)，并有良好的胃毒、觸殺和一定的熏蒸作用，且對人畜無害(賀紅武和劉釗杰，2001)。

隨著馬拉硫磷殺蟲劑的過量施用，害蟲對藥物的敏感性發(fā)生變化并產(chǎn)生一定抗性。目前對其抗性的生化機(jī)制研究如下:昆蟲乙酰膽堿酯酶(AChE)活性升高是產(chǎn)生馬拉硫磷抗性的一個重要機(jī)制(唐振華和周成理，1992;Fournier et al.，1993;Zhu et al.，1999;Taskin et al.，2004;Magana et al.，2007;)，其他可能的因素有酯酶(Ests)活性的升高(高希武等，1992;Zhu et al.，1999;Magana et al.，2007);多功能氧化酶(MFO)活性的升高(Motoyama et al.，1980)以及谷胱甘肽－S－轉(zhuǎn)移酶(GSTs)活性的變化(Motoyama et al.，1980;高希武等，1992;Taskin et al.，2004;何艷萍等，2005)。當(dāng)前研究重點(diǎn)大多集中于馬拉硫磷抗性機(jī)制研究，而馬拉硫磷對解毒代謝酶的影響還未見報道，嚴(yán)重地阻礙了其抗性延緩和治理策略的制定。

本實(shí)驗(yàn)以東亞飛蝗為研究對象，在浸葉法測定馬拉硫磷對東亞飛蝗3齡蝗蝻毒力的基礎(chǔ)上，研究了其對解毒代謝酶的影響，以期為馬拉硫磷的合理使用、抗性延緩和抗性治理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

東亞飛蝗蝗卵2007年采集于河北滄州，室內(nèi)孵化飼養(yǎng)傳代至今，未接觸過任何殺蟲劑。蟲卵在人工氣候培養(yǎng)箱中孵化，溫度(30±2)℃，濕度為(60+5)%，光照時間∶黑暗時間=14 h∶10 h。將同一時間孵化的蝗蝻轉(zhuǎn)移到60 cm×50 cm×70 cm 規(guī)格的養(yǎng)蟲籠中用新鮮小麥和麥麩飼養(yǎng)傳代。

1.2 主要試劑及儀器

1.2.1 供試試劑

馬拉硫磷原藥由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所農(nóng)藥研究室提供;DTNB(5，5－二硫雙(2－硝基苯甲酸))、ATChI(碘化硫代乙酰膽堿)、考馬斯亮藍(lán)G－250、CDNB(1－氯－2，4－二硝基苯)、DCNB(1，2－二氯－4－硝基苯)均為Sigma 產(chǎn)品;α－NA(乙酸－1－萘酯)、p－NA(對硝基苯甲醚)、NADPH(還原型輔酶II)均購自Amresco 公司;GSH(還原型谷胱甘肽)、固藍(lán)RR 鹽、牛血清蛋白購自Solarbio 公司;其余藥品為國產(chǎn)分析純。

1.2.2 供試儀器

智能人工氣候箱(寧波海曙塞福實(shí)驗(yàn)儀器廠)、立式壓力蒸氣滅菌器(上海博訊實(shí)驗(yàn)有限公司)、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)、SartoriusBS224S 天平、3K15 型冷凍離心機(jī)(Sigma 公司)、H2O3－PRO 恒溫金屬浴(金銀杏生物科技有限公司)、VERSAmax 型酶標(biāo)儀(美國Molecular Device 公司)。

1.3 生物測定

試驗(yàn)采用浸漬葉片法(陳年青，1990)測定馬拉硫磷對蝗蟲的毒力效果，首先將馬拉硫磷原藥用丙酮配制成一定濃度的母液，然后用雙蒸水將母液稀釋為不同濃度。將新鮮無污染的小麥葉，浸在不同濃度的藥液中5 s 后取出，室內(nèi)晾干后等量放入飼養(yǎng)盆中。挑選大小一致的3齡蝗蟲若蟲，每個處理15頭，重復(fù)次數(shù)為3，并用雙蒸水作為對照，飼養(yǎng)于養(yǎng)蟲室，每天統(tǒng)計死亡蟲數(shù)。以解剖針輕觸蟲體，無明顯反應(yīng)者為死亡。

計算處理死亡率，并采用SPSS 數(shù)據(jù)處理軟件(賈春生，2006)計算馬拉硫磷48 h和72 h 的毒力回歸方程及LC50和95%置信區(qū)間。

1.4 酶液的制備

取馬拉硫磷藥物處理48 h 后存活的蝗蟲，加入適量0.1 M 的磷酸鹽緩沖液(酯酶:緩沖液pH 7.0，1.5mL/頭，含0.1%TritonX－100;多功能氧化酶O－脫甲基活力:pH7.3，1mL/頭含1 mM EDTA和1 mM DTT;谷胱甘肽－S－轉(zhuǎn)移酶:pH7.5，1.5mL/頭;乙酰膽堿酯酶:pH7.0，1.5mL/頭)冰浴勻漿3 min，勻漿液在10，000 rpm、4℃條件下離心10 min。取上清液在15，000 rpm、4℃條件下再離心20 min，所獲得的上清液用作酶活性測定。

1.5 酶活的測定

1.5.1 蛋白含量測定

酶液中蛋白含量采用Bradfold(1976)考馬斯亮藍(lán)方法，牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，用酶標(biāo)儀在595 nm 處讀取OD 值，計算樣品蛋白含量。

1.5.2 全酯酶活性測定

參考韓召軍等(Han et al.，1998)方法，在酶標(biāo)板加樣孔中依次加90μL 0.1 M pH7.0 磷酸鹽緩沖液、200μL 底物與顯色劑的混合液(α－NA 10 mg、固藍(lán)RR 20 mg 分別溶于1mL 丙酮，分別取200μL 用緩沖液定容至8mL，過濾。)，最后加入10μL 酶液。迅速置于酶標(biāo)儀在450 nm 波長下，每隔25 s 記錄一次光密度值，共記錄10 min，樣品測定時設(shè)置3個重復(fù)，酶促反應(yīng)溫度為27℃，數(shù)據(jù)記錄和處理由Softmax Pro 6.1 軟件進(jìn)行。

1.5.3 谷胱甘肽－S－轉(zhuǎn)移酶活性測定

參照Oppenoorth(1976)報道的方法，以CDNB 為底物時，在96 孔酶標(biāo)板中每孔分別加入90μL 0.1 M pH7.5 磷酸鹽緩沖液，10μL 酶液，100μL 1.2 mM CDNB和100μL 6 mM GSH。以DCNB 為底物時，在96 孔酶標(biāo)板中每孔加入50μL酶液，100μL 1.2 mM DCNB和100μL 6 mM GSH。置于酶標(biāo)儀在340 nm 波長下，每隔25 s 記錄一次光密度值，共記錄10 min，樣品測定時設(shè)置3個重復(fù)，酶促反應(yīng)溫度為27℃，數(shù)據(jù)記錄和處理由Softmax Pro 6.1 軟件進(jìn)行。

1.5.4 多功能氧化酶O－脫甲基活力測定

參照Hansen和Hodgson(1971)的方法，在96 孔酶標(biāo)板中，每孔依次加入100μL 2mM 的p－NA、50μL 酶液，在27℃下溫育2min，然后加入40μL，9.6 mM 的NADPH。置于酶標(biāo)儀在405 nm波長下，每隔25 s 記錄一次光密度值，共記錄10 min，樣品測定時設(shè)置3個重復(fù)，酶促反應(yīng)溫度為27℃，數(shù)據(jù)記錄和處理由Softmax Pro 6.1 軟件進(jìn)行。

1.5.5 乙酰膽堿酯酶活性測定

參考韓召軍等方法(Han et al.，1998)，在酶標(biāo)板加樣孔中依次加50μL，0.1M pH7.0 磷酸鹽緩沖液、50μL 酶液、100μL 45 μM DTNB和100μL 1.5 mM ATChI。置于酶標(biāo)儀在405 nm 波長下，每隔30 s 記錄一次光密度值，共記錄40個值，樣品測定時設(shè)置3個重復(fù)，酶促反應(yīng)溫度為27℃，數(shù)據(jù)記錄和處理由Softmax Pro 6.1 軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬拉硫磷對東亞飛蝗的毒力測定

馬拉硫磷對東亞飛蝗3齡蝗蝻室內(nèi)毒力測定，結(jié)果表明:處理48 h 的LC50值為448.89 mg/L，處理72 h 的LC50值為315.61 mg/L。

2.2 不同濃度馬拉硫磷處理東亞飛蝗相關(guān)生化酶活性變化

從表1 中可以看出，取接近于LC0(7.48 mg/L)、LC5(37.4 mg/L)、LC30(187 mg/L)的3個馬拉硫磷濃度處理東亞飛蝗48h 后，其體內(nèi)的解毒酶活性出現(xiàn)了一定變化。全酯酶(Ests)和乙酰膽堿酯酶(AChE)活性受到抑制并且變化趨勢相同，當(dāng)濃度為37.4 ppm 時，其酶活性分別為對照組的0.28和0.32倍。分別以CDNB和DCNB 為底物測定東亞飛蝗谷胱甘肽S－轉(zhuǎn)移酶(GSTs)活性，其變化趨勢不同。以CDNB 為底物時，經(jīng)低濃度馬拉硫磷處理后東亞飛蝗GSTs 活性受到抑制，但是當(dāng)處理濃度為187 ppm 時其活性被誘導(dǎo)升高1.35倍;以DCNB 為底物時，測得東亞飛蝗GSTs比活力較小，但是其活性呈現(xiàn)先升高后降低的誘導(dǎo)趨勢，當(dāng)馬拉硫磷濃度為37.4 ppm 其活性最高為1.34倍。多功能氧化酶(MFO)活性受到抑制，但無顯著性差異，濃度為7.48 ppm 時活性最低為0.68倍。

表1 馬拉硫磷對東亞飛蝗的毒力Table 1 Toxicity of malathion to Locusta migratoria manilensis

表2 不同濃度馬拉硫磷處理下東亞飛蝗相關(guān)酶活性Table 2 The enzymes activities assays of Locusta migratoria manilensis to malathion

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)以3齡東亞飛蝗為測定對象，用馬拉硫磷殺蟲劑進(jìn)行了室內(nèi)毒力測定，并分析了東亞飛蝗體內(nèi)解毒代謝酶的變化趨勢。試驗(yàn)結(jié)果表明馬拉硫磷作用72 h 后對東亞飛蝗的LC50值為315.61 mg/L 。紀(jì)明山等(2012)對草原蝗蟲毛足棒角蝗和亞洲小車蝗3齡若蟲進(jìn)行了室內(nèi)藥劑的篩選試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)馬拉硫磷對這兩種蝗蟲毒力最低，72h 的LC50值分別為422.9821 mg/L和317.8538 mg/L。李翠蘭等(2005)報道山西晉源地區(qū)的中華稻蝗5齡若蟲經(jīng)馬拉硫磷作用24 h，其LC50值為549 mg/L。上述結(jié)果說明馬拉硫磷對不同的蝗蟲具有相近的毒力效果，因此可用于蝗蟲的大面積混合防治，而不會出現(xiàn)防效不一的結(jié)果。

已知馬拉硫磷主要作用于乙酰膽堿酯酶(AChE)靶標(biāo)酶，使AChE 活性部位磷?；种破浠钚?，引起乙酰膽堿在突觸間作用時間延長，從而引起突觸后膜乙酰膽堿受體的超興奮，使昆蟲痙攣死亡(張宗炳和曹驥，1990)。劉波(2003)等報道LD10劑量的馬拉硫磷誘導(dǎo)了棉鈴蟲Helicoverpa armigera 體內(nèi)的AChE 的活性。但是亞致死劑量的馬拉硫磷作用24 h 后抑制花翅搖蚊Chironomus kiiensis 體內(nèi)的AChE 活性(劉洪霞，2005)。本研究發(fā)現(xiàn)馬拉硫磷處理48 h 后，抑制了東亞飛蝗AChE 活性，并且隨著馬拉硫磷濃度的升高呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢。不同的昆蟲經(jīng)馬拉硫磷處理后體內(nèi)AChE 活性變化情況不同，這可能與昆蟲的處理方式和AChE 活性測定方法不同有關(guān)，但對體內(nèi)AChE 的抑制被認(rèn)為是最可能的結(jié)果，在馬拉硫磷抗性機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)AChE 活性升高是造成昆蟲產(chǎn)生抗性的重要原因(Zhu et al.，1995)。

殺蟲劑進(jìn)入昆蟲體內(nèi)，常常會遭受不同酶系的進(jìn)攻，與此相關(guān)的主要有酯酶、谷胱甘肽－S－轉(zhuǎn)移酶、多功能氧化酶(冷欣夫和唐振，1996)。劉澤文等研究發(fā)現(xiàn)在馬拉硫磷的抗性發(fā)展過程中，褐飛虱酯酶活性在不斷的上升，并且存在較好的相關(guān)性;而多功能氧化酶和谷胱甘肽－S－轉(zhuǎn)移酶只在抗性發(fā)展的最初階段起到一定的作用(劉澤文等，2003)。在本試驗(yàn)中東亞飛蝗全酯酶、谷胱甘肽－S－轉(zhuǎn)移酶(以CDNB 為底物)和多功能氧化酶都被抑制，但全酯酶、谷胱甘肽－S－轉(zhuǎn)移酶(以CDNB 為底物)的活性隨著馬拉硫磷濃度的升高呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，而MFO 活性變化不明顯。由此推測乙酰膽堿酯酶、全酯酶和谷胱甘肽－S－轉(zhuǎn)移酶活性的上升可能是導(dǎo)致東亞飛蝗對馬拉硫磷抗性發(fā)展的重要原因之一，多功能氧化酶活性的變化可能促進(jìn)了其抗性的發(fā)展。

明確馬拉硫磷對昆蟲體內(nèi)解毒代謝酶的影響，可為其抗性的延緩和抗性治理奠定一定的理論基礎(chǔ)。針對抗性的問題，劉澤文(劉澤文等，2004)研究發(fā)現(xiàn)在馬拉硫磷抗性品系中磷酸三苯酯(TPP)對馬拉硫磷的增效作用達(dá)到9.15倍，增效劑的使用可以增強(qiáng)馬拉硫磷的毒力，降低抗性的影響。因此，作為延緩或者阻止抗性發(fā)展的主要手段，殺蟲劑與增效劑混用、不同作用機(jī)理的殺蟲劑混用和殺蟲劑的輪用等措施將勢在必行。

References)

Bradford MM，1976.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding.Analytical Biochemistry，72:248－254.

Chen NQ，1990.Technology of Pesticide Bioassay.Beijing:Beijing Agriculture University Press.66－68.［陳年青，1990.農(nóng)藥生物測定技術(shù).北京:北京農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社.66－68.］

Fournier D，Mutero A，Pralavorio M，1993.Drosophila acetylcholinesterase:mechanisms of resistance to organophosphates.Chem.Biol.Interact，87(1－3):233－238.

Gao XW，Zheng BZ，Cao BJ，1992.Resistance in Myzus persicae to organophosphorus and carbamate insecticides in China.Acta Phytophylacica Sinica，19(4):365－371.［高希武，鄭炳宗，曹本，1992.桃蚜對有機(jī)磷和氨基甲酸酯抗性機(jī)制研究.植物保護(hù)學(xué)報，19(4):365－371］

Han ZJ，Moores GD，Denholm I，1998.Association between biochemical markers and insecticide resistance in the Cotton Aphid，Aphis gossypii Glover.Pesticide Biochemistry and Physiology，62:164－171.

Hansen LG，Hodgson E，1971.Inhibition of microsomal oxidoses from the housefly.Pesticide Biochemistry and Physiology，1:109－119.

He HW，Liu ZJ，2001.Developing trend of organic phosphorus pesticides and the exploitation and utilization of the low toxicity organic phosphorus.World Pesticides，23(4):26－31.［賀紅武，劉釗杰，2001.有機(jī)磷農(nóng)藥的發(fā)展趨勢與低毒有機(jī)磷殺蟲劑的開發(fā)和利用(下).世界農(nóng)藥，23(4):26－31］

He YP，Liu X，Ma EB，2005.Two metabolic enzymes of oriental migratory locust，Locusta migratoria manilensis(Meyen)，from two locust areas with different ecological characteristics.Acta Ecologica Sinica，25(2):203－209.［何艷萍，劉新，馬恩波，2005.兩個不同生態(tài)特征蝗區(qū)東亞飛蝗的兩種代謝酶.生態(tài)學(xué)報，25(2):203－209］

Hong XY，Ding JH，2007.Agricultural Entomology.Beijing:China Agriculture Press.134－140.［洪曉月，丁錦華，2007.農(nóng)業(yè)昆蟲學(xué).北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，134－140］

Ji MS，Liu ZC，Li XW，Yan KC，Zhu H，Han JD，2012.Pharmaceutical screening of grassland locusts in lab.Agrochemicals，51(2):148－150.［紀(jì)明山，劉周成，李修偉，顏克成，朱赫，韓金棟，2012.防治草原蝗蟲有效藥劑的室內(nèi)篩選.農(nóng)藥，51(2):148－150］

Jia CS，2006.Calculatiang the LC50of insecticides with software SPSS.Entomological Knowledge，43(3):414－417.［賈春生，2006.利用SPSS 軟件計算殺蟲劑的LC50.昆蟲知識，43(3):414－417］

Len XF，Tang ZH，Wang QC，1996.The Insecticidal Molecular Toxicology and the Resistence of Insects.Beijing:China Agriculture Press，9－27.［冷欣夫，唐振華，王前長，1996.殺蟲藥劑分子毒理學(xué)及昆蟲抗藥性.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，9－27］

Li CL，Lu FP，Guo YP，Ma EB，2005.Acute toxicities of Malathion，F(xiàn)ipronile and Cyhalothrin to fifth instar nymphs of rice gresshopper Oxya chinensis.Journal of Agro－Environment Sicence，24(3):562－566.［李翠蘭，盧芙萍，郭亞平，馬恩波，2005.馬拉硫磷銳勁特和氯氟氰菊酯對中華稻蝗五齡若蟲的急性毒性.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報，24(3):562－566］

Liu B，Gao XW，Zhen BZ，2003.Effect of sublethal doses of anticholinesterase agents on toxicity of insecticides and their induction to acetylcholinesterase(AchE)in Helicoverpa armigera.Acta Entomologica Sinica，46(6):691－696.［劉波，高希武，鄭炳宗，2003.抗膽堿酯酶劑亞致死劑量對棉鈴蟲毒力的影響及對乙酰膽堿酯酶的誘導(dǎo)作用.昆蟲學(xué)報，46(6):691－696］

Liu HX，Shi XY，Gao XW，2005.The optimum in acetylcholinesterase assaye and the sensibility to organophosphorus of Chironomus kiiensis.Journal of Safety and Environment，5(5):67－70.［劉洪霞，史雪巖，高希武，2005.搖蚊乙酰膽堿酯酶最佳反應(yīng)體系的建立及有機(jī)磷類藥劑敏感度比較.安全與環(huán)境學(xué)報，5(5):67－70］

Liu ZW，Han ZJ，Zhang LC，Wang YC，2003.The roles of esterase，MFO and GSTs in malathion resistance development in brown planthopper.Journal of Nanjing Agricultural University，26(1):24－28.［劉澤文，韓召軍，張玲春，王蔭長，2003.解毒酶系在褐飛虱對馬拉硫磷的抗性發(fā)展中的作用.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，26(1):24－28］

Liu ZW，Han ZJ，2004.Cross resistance of malathion resistant strain of Nilaparvata lugens and its biochemical aspects.Journal of Nanjing Agricultural University，27(1):55－58.［劉澤文，韓召軍，2004.抗馬拉硫磷褐飛虱品系的交互抗性及其生化分析.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，27(1):55－58］

Magana C，Hernandez－Crespo P，Ortego F，2007.Resistance to malathion in field populations of Ceratitis capitata.J.Econ.Entomol.，100(6):1836－1843.

Motoyama N，Hayaoka T，Nomura K，1980.Glutathione S－transferase，their role in the metabolism of organophours insecticides.Review Biochemistry Toxicol.，2:49－51.

Oppenoorth FJ，Welling W，1976.Biochemistry and physiology of resistance.Insecticide Biochemistry and Physiology.New York:Plenum Press，507－551.

Tang ZH，Zhou CL，1992.The acetylcholinesterase sensibility of Plutella xylostella(Linn.)in resistant strain.Acta Entomologica Sinica，35(4):385－392.［唐振華，周成理，1992.抗性小菜蛾的乙酰膽堿酯酶敏感性.昆蟲學(xué)報，35(4):385－392.］

Taskin V，Kence M，2004.The genetic basis of malathion resistance in housefly(Musca domestica L.)strains from Turkey.Genetika，40(11):1475－1482.

Zhang BZ，Cao J，1990.Pest Control:Strategy and Method.Beijing:Science Press，143－154.［張宗炳，曹驥，1990.害蟲防治:策略與方法.北京:科學(xué)出版社，143－154］

Zhu KY，Gao JR，1995.Increased activity associated with reduced sensitivity of acetylcholinesterase in organophosphate resistant greenbug，Schizaphis graminum(Homoptera:Aphididae).Pestic Sci.，55:11－17.