王 滔，楊 巽，衣建坤，王 玉，孫 宇，席景會

(吉林大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院，長春 130062)

亞洲玉米螟Ostrinia furnacalis屬于鱗翅目，螟蛾科，蛀食性害蟲，是危害玉米的主要害蟲之一，玉米是我國重要的糧食作物，每年由于亞洲玉米螟的為害造成大量損失，所以防治亞洲玉米螟有著重要的意義。昆蟲具有開放的體液循環(huán)系統(tǒng)，其血淋巴負(fù)擔(dān)著重要的物質(zhì)和能量的轉(zhuǎn)運(yùn)功能，而其中的血漿蛋白正是行使這些功能的主要成員(楊捷頻等，2009)，在昆蟲的防御、抗凍、免疫(Jana et al.，2012)、損傷應(yīng)答等方面起重要作用(王巖等，2009)，所以血漿蛋白提取方法的比較為研究昆蟲生理生化活動及其分子機(jī)制提供了基礎(chǔ)，昆蟲蛋白制備方法較多，但是對于鱗翅目幼蟲的血漿蛋白制備方法基本大多數(shù)都是直接裂解法(鐘伯雄等，2003;崔穎俊等，2008)，對于聚丙烯酰胺凝膠電泳分析的效果并不理想。為了探尋更理想的血淋巴制備方法，本研究比較了3種蛋白質(zhì)提取方法，為后續(xù)進(jìn)一步的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試蟲:亞洲玉米螟飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)箱中，采用人工飼養(yǎng)(喬利等，2008)，溫度控制26±0.5℃，光周期16L∶8D，相對濕度75%～85%，收集5 齡幼蟲作為試蟲。

1.2 血淋巴的提取方法

將試蟲冷凍麻醉，剪掉腹足，吸取血淋巴，配合雙管離心法(Xu et al.，2006)，收集血淋巴，-80℃中儲存?zhèn)溆?Britto et al.，2012)。

1.3 蛋白樣品制備

1.3.1 三氯乙酸(TCA)/丙酮沉淀法

參照Mechin 等報道的方法(Mechin et al.，2007)，略作修改。取-80℃血淋巴樣品，4℃離心取上清，分裝每管20μL，加 TCA/丙酮，-20℃沉淀，4℃ 離心棄上清，將沉淀用丙酮和80%丙酮各洗1 遍，沉淀真空離心干燥1 min，蛋白粉末-80℃冰箱中儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 PEG 提取法

取-80℃血淋巴樣品，4℃離心，取上清，分裝為每管20μL，加入80μL 50%的PEG，使終濃度為40%，冰浴1 h，4℃離心，棄上清，將沉淀用丙酮和80% 丙酮各洗一遍，真空離心干燥1 min，蛋白粉末-80℃冰箱中儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 直接裂解法

參考Nguyen 等的方法(Nguyen et al.，2007)，取-80℃血淋巴樣品，4℃離心，取上清，分裝為每管20μL，加入200μL 4℃預(yù)冷的裂解液，4℃離心兩次取上清分裝，樣品凍存于-80℃冰箱中備用。

1.4 蛋白樣品的溶解

取凍存的蛋白質(zhì)樣品，加入溶解液［5M 尿素，2M 硫脲，2% CHAPS，20 mM DTT，0.002%溴酚藍(lán)］中，30℃孵育1.5 h，充分溶解后于13000 rpm離心30 min，取上清進(jìn)行蛋白濃度測定。

1.5 蛋白含量的測定

參照Bradford 法進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度的測定(Toyama et al.，2007)。

1.6 SDS-PAGE 電泳

采用不連續(xù)垂直板十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進(jìn)行分析。分離膠濃度12.5%，濃縮膠濃度3%，凝膠厚度為1 mm，銀染方法進(jìn)行凝膠染色(Yan，2000)，染色后凝膠用Epson Expression 10000XL 掃描儀進(jìn)行掃描，重復(fù)3 次，并利用Quantity One 軟件進(jìn)行圖像分析。

1.7 雙向電泳

取300μg 蛋白，補(bǔ)加水化液至340μL，膠條為pH4～7 的18 cm 的IPG 膠條，在水化槽中室溫水化16 h，等電聚焦儀中等電聚焦，之后每根膠條在平衡緩沖液Ⅰ和平衡緩沖液Ⅱ中平衡15 min。然后將膠條轉(zhuǎn)移至12.5%濃度，厚度為1.5 mm 的聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)上，進(jìn)行第二向垂直電泳，銀染方法進(jìn)行凝膠染色(Yan，2000)，染色后凝膠用Epson Expression 10000XL 掃描儀進(jìn)行掃描，每個方法三次重復(fù)，然后利用ImageMasterTM2D Platinum 6.0 軟件進(jìn)行圖像分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方法的蛋白提取率

用3種方法獲得的亞洲玉米螟血漿蛋白的提取率有明顯不同，結(jié)果見圖1，直接裂解法的提取率最高，為41.91μg/μL，TCA/丙酮沉淀的提取率次之，為14.32μg/μL，PEG 提取法的提取率為8.47μg/μL。利用SPSS13.0 統(tǒng)計軟件，利用One-Way ANOVA 進(jìn)行分析，采用LSD 法進(jìn)行多重比較，結(jié)果表明:3種蛋白提取方法的蛋白提取率具有極顯著差異(P＜0.01)。

圖1 不同提取方法的蛋白質(zhì)提取率Fig.1 The rate of protein in extraction from different ethods

2.2 SDS-PAGE 電泳圖譜分析

三種方法提取的血漿蛋白SDS-PAGE 電泳結(jié)果見圖2，PEG 提取法得到的蛋白在圖譜上顯示的條帶數(shù)最多，為39 條，且從14.4 kDa～116 kDa的范圍內(nèi)分布均勻，條帶清晰;TCA/丙酮沉淀法得到的蛋白條帶明顯減少，只有23 條，主要集中于35.0 kDa 以上，低分子量的蛋白條帶明顯減少，70 kDa 附近蛋白表達(dá)量過大，使蛋白條帶不易分辨;直接裂解法得到的蛋白在圖譜上顯示的條帶數(shù)僅為22 條，除高分子量的條帶清楚外，小分子量的條帶可辯率很低。

2.3 雙向電泳圖譜分析

為了進(jìn)一步檢測亞洲玉米螟血漿蛋白質(zhì)制備效果，對不同制備方法得到的蛋白樣品進(jìn)行雙向電泳分析，結(jié)果如圖3和圖4，直接裂解法獲得332個蛋白質(zhì)點(diǎn)，PEG 提取法獲得874個蛋白質(zhì)點(diǎn)，而TCA/丙酮沉淀法制備的樣品只得到210個蛋白質(zhì)點(diǎn)。其中PEG 提取法得到的雙向電泳圖譜背景較清晰，蛋白分布最廣，在各個分子量和等電點(diǎn)區(qū)域得到的蛋白點(diǎn)都是最多的，分離效果較好。直接提取法的圖譜中的蛋白點(diǎn)明顯少很多，從圖譜中可見，各個區(qū)域顯現(xiàn)的蛋白點(diǎn)數(shù)具有不同程度減少，相同蛋白的表達(dá)豐度也有不同程度的降低。TCA/丙酮沉淀法的圖譜得到的蛋白點(diǎn)數(shù)最少，且得到的蛋白點(diǎn)有明顯的彌散情況，相同的蛋白的表達(dá)豐度也明顯的降低。另外PEG 提取法得到的電泳圖譜重復(fù)性較好，TCA/丙酮沉淀法次之，直接提取法重復(fù)性較差。

圖3 不同蛋白提取方法的2-DE 凝膠圖譜Fig.3 2-DE analyses of proteins from different methods

3 結(jié)論與討論

TCA/丙酮沉淀法是常用的蛋白質(zhì)提取方法(Xu et al.，2007)，這種方法能高效的去除蛋白質(zhì)樣品中的鹽離子，并且能減少蛋白質(zhì)水解作用和其它蛋白酶的修飾對蛋白分離結(jié)果的影響(安少利等，2010)。TCA/丙酮法是對蛋白進(jìn)行多次沉淀后得到的樣品，制備的蛋白樣品為淡黃色粘稠狀沉淀，加蛋白溶解液溶解后有大量膠狀不溶物，再溶性很差，易造成很多蛋白質(zhì)的損失，并且對色素，多糖等雜質(zhì)的去除效果一般(Gorg et al.，2000)。亞洲玉米螟5 齡幼蟲血淋巴有很多色素、多糖和脂類等干擾物質(zhì)較多，所以用TCA/丙酮沉淀法提取血漿蛋白質(zhì)得到的SDS-PAGE 蛋白條帶數(shù)較少，2-DE 圖譜所檢測到的蛋白點(diǎn)數(shù)也是最少的。

直接裂解法提取蛋白的原理是將蛋白質(zhì)溶解在裂解液中，主要針對可溶性蛋白，其操作布驟簡單，方便快速，有利于蛋白降解，加上成本較低，在微生物的蛋白制備中廣泛應(yīng)用(Barrios-Llerena et al.，2007)。但是在亞洲玉米螟血漿蛋白的提取中，由于脂類、多糖等雜質(zhì)的干擾，而此方法對雜質(zhì)的去除效果差，使蛋白定量不準(zhǔn)確，SDS-PAGE 中分離的條帶較少且不清晰，進(jìn)行雙向電泳時，第一步IEF時電壓不穩(wěn)定，等電聚焦時間較長，使得蛋白質(zhì)大量降解，所以圖譜上顯現(xiàn)的蛋白點(diǎn)很少，并且分布的范圍較窄，并且有彌散的現(xiàn)象，所以此方法不適合定量比較研究，特別是進(jìn)行差異蛋白質(zhì)組的研究。

利用PEG 提取法制備的蛋白樣品呈乳白色，加入蛋白溶解液溶解后只有少量不溶解，再溶性比較好，進(jìn)行SDS-PAGE和2-DE 圖譜的效果都比較好，得到的點(diǎn)是最多的也是分布最廣的，分離情況也較好。

因此，利用PEG 提取法進(jìn)行亞洲玉米螟血漿蛋白樣品的制備，蛋白點(diǎn)數(shù)最多，分布最廣泛，分辨率高，重復(fù)性好，適于進(jìn)行后續(xù)差異蛋白質(zhì)組的相關(guān)研究。

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