河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院普通外科，河北 石家莊 050031

微小RNA-187*在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)及其對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的影響

劉博 田延鋒 趙增仁 樊智彬 張麗靜 賀新奇 高利飛

河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院普通外科，河北 石家莊 050031

背景與目的：微小RNA(microRNA, miRNA)在細(xì)胞分化、細(xì)胞周期及凋亡過程中發(fā)揮重要作用。miRNA通過擴(kuò)增、缺失、突變和沉默等機(jī)制影響癌癥的發(fā)生、發(fā)展。本研究探討miR-187*在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)和臨床意義，以及上調(diào)miR-187*表達(dá)量對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的影響。方法：采用實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative reverse transcription-PCR，real-time PCR)的方法在40例結(jié)直腸癌患者組織標(biāo)本中檢測miR-187*的表達(dá)水平，結(jié)合病理資料分析其臨床意義。HCT116細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-187*mimics后，用Annexin-Ⅴ FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測miR-187*對(duì)凋亡的影響。結(jié)果：miR-187*在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)量為0.165(0.106，0.428)，明顯低于正常黏膜組織表達(dá)量［0.334(0.211，0.712)］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且在黏液癌及高齡患者中下調(diào)更明顯(P＜0.05)。將miR-187*mimics轉(zhuǎn)染至HCT116中可提高其表達(dá)量，通過流式技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組早期凋亡率[(23.010±1.279)%]相比較，實(shí)驗(yàn)組早期凋亡率［(26.748±1.098)%］升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論：miR-187*在結(jié)直腸癌組織中低表達(dá)，并且與組織學(xué)類型及年齡有關(guān)；miR-187*表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)HCT116早期凋亡；miR-187*具有潛在抑癌作用。

結(jié)直腸腫瘤；微小RNA；microRNA-187*；凋亡

結(jié)直腸癌是常見的惡性腫瘤之一。美國全球癌癥統(tǒng)計(jì)分析報(bào)告顯示：結(jié)直腸癌在常見癌癥中位居前三。2008年，全球范圍內(nèi)新增約1 200萬結(jié)直腸癌患者，其中60.8萬例死亡(占所有癌癥死亡人數(shù)的8%，成為第四大最常見的癌癥死亡的原因)［1］。我國農(nóng)村和城市結(jié)直腸癌發(fā)病率均呈逐年升高趨勢(shì)［2］，結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制仍不明確。miRNA的出現(xiàn)為結(jié)直腸癌的研究提供了新的切入點(diǎn)。miRNAs是一類小的可調(diào)控基因表達(dá)的內(nèi)源性非編碼RNA，長度為19～24 bp，廣泛存在于真核細(xì)胞生物中，主要在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)功能。miRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中所扮演的角色受到越來越多研究者的關(guān)注，結(jié)合表觀遺傳學(xué)探討其表達(dá)調(diào)節(jié)也是當(dāng)前研究熱點(diǎn)［3］。本課題組早期利用基因芯片技術(shù)對(duì)miRNAs進(jìn)行篩查發(fā)現(xiàn)，miR-187*在結(jié)直腸癌組織中低表達(dá)。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)miR-187*參與冠心病［4］、男性胸主動(dòng)脈瘤［5］疾病發(fā)生、發(fā)展的調(diào)控，但對(duì)miR-187*在腫瘤中研究的文獻(xiàn)較少。本研究旨在探討miR-187*在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)、臨床意義；上調(diào)miR-187*表達(dá)量對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 臨床標(biāo)本

收集2011年5月—2012年5月河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院、河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院結(jié)直腸癌手術(shù)標(biāo)本40例。每例標(biāo)本分別取自結(jié)直腸原發(fā)腫瘤組織及上(下)切緣正常黏膜且術(shù)后病理證實(shí)無癌組織侵犯。新鮮標(biāo)本離體后迅速置于液氮中，于-80 ℃保存。40例患者術(shù)前未接受任何化療和放療。

1.1.2 細(xì)胞株

結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116由香港中文大學(xué)消化疾病研究所于君饋贈(zèng)。

1.1.3 主要試劑

McCoy’s 5A培養(yǎng)液、胎牛血清(FBS)、青霉素鏈霉素(PEST)均購自美國Gibco公司。胰蛋白-乙二胺四乙酸(EDTA)消化液購自北京諾博萊德科技有限公司。Annexin V-FITC試劑盒購自深圳欣博盛生物科技有限公司。miR-187* mimics和negative control轉(zhuǎn)染試劑盒購自廣州銳博生物科技有限公司。LipofectmanineTM2000及TRIzol試劑均購自美國Invitrogen公司。實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative reverse transcription-PCR，real-time PCR)采用All-in-One? miRNA qRT-PCR 檢測試劑盒、內(nèi)參U6、miR-187*的引物均購自廣州復(fù)能基因有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

HCT-116細(xì)胞使用McCoy's 5A培養(yǎng)液，并在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入10% FBS及1×PEST，在37 ℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的水飽和濕度條件下培養(yǎng)。每1～2 d換液傳代1次。當(dāng)細(xì)胞生長至106～107時(shí)收集細(xì)胞，備用提取RNA。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染前1天，將適量(約4×104～5×104)細(xì)胞接種在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，每孔加入不含抗生素的細(xì)胞培養(yǎng)液400 μL。密切觀察細(xì)胞生長情況，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到 30%～50%時(shí)，開始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)組(miR-187* mimics)和對(duì)照組(negative control, NC)的轉(zhuǎn)染。用50μL的不含血清培養(yǎng)基Opti-MEM 對(duì)1.25 μL濃度為20 μmol/L的miR-187* mimics和negative control進(jìn)行稀釋，輕輕振蕩混勻，室溫下溫育5 min。用50 μL的不含血清培養(yǎng)基Opti-MEM 對(duì)1 μL LipofectmanineTM2000進(jìn)行稀釋，輕輕振蕩混勻，室溫下溫育5 min。將稀釋好的miR-187* mimics和negative control和LipofectmanineTM2000混合，輕柔混勻，室溫下溫育20 min，以形成混合物。100 μL混合物加到培養(yǎng)板的孔中，輕輕搖晃細(xì)胞培養(yǎng)板使其與培養(yǎng)液混勻。將細(xì)胞培養(yǎng)板置于CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中，在37 ℃下培養(yǎng)4～6 h后，移除每孔中含有混合物的培養(yǎng)液，更換新的培養(yǎng)液。繼續(xù)在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)24 h后，進(jìn)行轉(zhuǎn)染后的其他實(shí)驗(yàn)檢測。

1.2.3 細(xì)胞凋亡檢測

取實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組細(xì)胞數(shù)量約為106，用4 ℃無菌PBS液洗滌細(xì)胞2次，用250 μL結(jié)合緩沖液將細(xì)胞稀釋為濃度2×105～5×105/mL細(xì)胞懸浮液。取195 μL細(xì)胞懸浮液加入5 μL FITC標(biāo)記的Annexin-Ⅴ，混勻后靜置3 min，然后加入10 μL濃度為20 μg/mL的PI?；靹蚝笫覝乇芄鉁赜?0 min。加入300 μL的結(jié)合緩沖液，混勻，立即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次做3個(gè)復(fù)孔。

1.2.4 組織標(biāo)本及結(jié)直腸癌細(xì)胞株中總RNA的提取

患者的組織標(biāo)本或細(xì)胞標(biāo)本中加入1 mL TRIzol勻漿，室溫下靜置5 min；加入0.2 mL氯仿，振蕩混勻后靜置5 min；4 ℃ 15 000×g離心15 min，吸取上層無色液相至另一管中，加入0. 5 mL異丙醇，室溫下放置15 min，4 ℃15 000 ×g離心15min，可見RNA沉淀在管底部或側(cè)壁。棄上清液，加75%乙醇1mL振蕩器混勻，4 ℃ 6 000 ×g離心5 min，棄上清液，靜置15 min后用無RNA酶水溶解混勻，分光光度計(jì)檢測RNA濃度及A260/A280的數(shù)值，且A260/A280＞1.8。

1.2.5 組織標(biāo)本miR-187*表達(dá)的檢測

采用qRT-PCR檢測患者癌組織及正常黏膜組織中miRNA-187*的表達(dá)，按照All-in-One?miRNA qRT-PCR檢測試劑盒說明書操作。取2 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以稀釋5倍cDNA為模板，qPCR擴(kuò)增miR-187*及U6的基因片段。反轉(zhuǎn)錄選用25 μL反應(yīng)體系：總RNA模板2 μg，2.5 U/ μL Poly A 多聚酶1 μL，逆轉(zhuǎn)錄酶混合物1 μL，5×反應(yīng)緩沖液1 μL，補(bǔ)無DNA酶無RNA酶水至25 μL。反應(yīng)條件：37 ℃ 60 min，85 ℃ 5 min。qRT-PCR選用20 μL反應(yīng)體系：2×All-in-One qPCR Mix 10 μL，All-in-One miRNA qPCR引物(2 μmol/L) 2 μL，通用銜接頭 PCR 引物(2 μmol/L) 2 μL，第一鏈cDNA (稀釋1∶5) 2 μL，50×ROX參考染料0.4 μL，補(bǔ)無RNA酶的水至20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，然后按95 ℃×10 s，60 ℃×30 s，72 ℃× 10 s，進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。其中細(xì)胞實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以中位數(shù)(四分位數(shù)間距)或表示，兩組間配對(duì)樣本采用Wilcoxon檢驗(yàn)或t檢驗(yàn)，兩組間獨(dú)立樣本采用Mann-Whitney檢驗(yàn)，重復(fù)測量數(shù)據(jù)采用雙因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miR-187*在癌組織和正常黏膜組織中的表達(dá)

miR-187*在40例患者癌組織中的表達(dá)量為0.165(0.106，0.428)，正常黏膜組織中的表達(dá)量為0.334(0.211，0.712)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.041，圖1)。

圖 1 miR-187＊在癌組織及正常黏膜的表達(dá)量Fig. 1 Expression of miR-187* in normal mucosa and cancer mucosa

2.2 miR-187*相對(duì)表達(dá)量與臨床病理的關(guān)系

miR-187*在黏液性腺癌中的表達(dá)量為0.110(0.070，0.390)，明顯低于非黏液癌［0.840(0.355，1.628)］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)；低齡患者(＜69歲)的表達(dá)量為1.270(0.435，1.955)，高齡患者(≥69歲)為0.390(0.150, 1.070)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.016)。miR-187*表達(dá)與分化程度、分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、性別無明顯關(guān)系，各指標(biāo)組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，表1)。

表 1 miR-187*的相對(duì)表達(dá)量與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系Tab. 1 The correlation of miR-187* expression in CRC with clinical significance

2.3 上調(diào)miR-187*表達(dá)量對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的影響

轉(zhuǎn)染mimics進(jìn)入HCT116細(xì)胞中，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組miR-187*表達(dá)量上調(diào)(圖2)。實(shí)驗(yàn)組早期凋亡率為(26.748±1.098)%，高于對(duì)照組［(23.010±1.279)%］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.024)；實(shí)驗(yàn)組晚期凋亡率為(4.393±0.715)%，與對(duì)照組［(3.940±0.710)%］相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，圖3)。

圖2 轉(zhuǎn)染后miR-187＊表達(dá)量Fig.2 Expression of miR-187* in the transfected cells

圖3 miR-187*對(duì)HCT116細(xì)胞凋亡影響Fig.3 The effect of miR-187* on cell apoptosis of HCT116 cells

3 討 論

miRNA主要通過與靶標(biāo)基因3’非翻譯區(qū)域(3’UTR)的完全或不完全配對(duì)，降解靶標(biāo)基因mRNA或抑制其翻譯，miRNA還可以直接作用于mRNA加快脫腺苷化，導(dǎo)致mRNA降解加速，從而參與調(diào)控個(gè)體發(fā)育，細(xì)胞凋亡、增殖、分化、代謝和應(yīng)激等生命活動(dòng)［6］。近幾年研究表明，miRNA可能通過類似癌基因、抑癌基因或其他方式調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸過程，表現(xiàn)出與癌基因或抑癌基因相似的生物學(xué)作用［7］；并且能與信號(hào)通路或原癌基因相互作用，對(duì)環(huán)境信號(hào)作出反應(yīng)，從而對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡、周期產(chǎn)生影響［8］。

miR-187*是miR-187家族的一員，位于18號(hào)染色體上［9］。Ho等［10］對(duì)45例毛細(xì)胞型星形細(xì)胞瘤標(biāo)本研究發(fā)現(xiàn)，miR-187*在癌組織中的表達(dá)水平低于正常組織表達(dá)水平的2～2.5倍。Ma等［11］在研究結(jié)直腸癌表達(dá)譜時(shí)也發(fā)現(xiàn)，miR-187*在結(jié)直腸癌中低表達(dá)。Liu等［12］應(yīng)用基因芯片技術(shù)對(duì)miRNAs在胃癌組織中篩查，并通過RT-PCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)miR-187*異常表達(dá)。隨后對(duì)miR-187*在10位健康人、10例胃癌患者、10例結(jié)直腸癌患者血清中表達(dá)水平進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)其在胃癌患者血清中表達(dá)水平最高、結(jié)直腸癌次之、健康人最低，胃癌患者血清表達(dá)水平與健康人血清表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示miR-187*可能成為胃癌早期診斷的指標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)首先通過qRT-PCR方法檢測miR-187*在結(jié)直腸癌組織及正常黏膜組織中的表達(dá)，結(jié)果miR-187*在結(jié)直腸癌組織中低表達(dá)，與Ma等［11］的研究結(jié)果一致。

黏液癌是組織學(xué)分型中的一重要亞型。我國學(xué)者通過對(duì)2 079例結(jié)直腸癌患者的臨床資料及預(yù)后生存期進(jìn)行回顧性研究，發(fā)現(xiàn)黏液癌患者預(yù)后差［13］。本實(shí)驗(yàn)通過分析臨床病理資料發(fā)現(xiàn)，miR-187*的相對(duì)表達(dá)量在黏液癌中低表達(dá)更明顯，提示miR-187*對(duì)判斷結(jié)直腸癌的惡性程度及預(yù)后有一定意義。Bouassida等［14］研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌年輕患者中組織學(xué)類型惡性度高、易侵犯血管發(fā)生轉(zhuǎn)移，但1年生存率無明顯變化。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-187*的表達(dá)下調(diào)與組織學(xué)類型及發(fā)病年齡均相關(guān)。國內(nèi)年齡＜39歲惡性腫瘤發(fā)病率處于較低水平，＞40歲快速升高，80歲達(dá)到高峰［2］。Chang等［15］通過對(duì)1988—2007年124 314例在中國臺(tái)灣癌癥登記的結(jié)直腸癌患者進(jìn)行流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，高年齡組的比例增加。本研究分析發(fā)現(xiàn)，miR-187*在高齡患者中的表達(dá)量較低，提示時(shí)序性的miR-187*表達(dá)下調(diào)，可能與隨年齡增長結(jié)直腸癌發(fā)病率逐步增高相關(guān)。

大量研究結(jié)果表明，miRNA參與調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)行為。Tsang等［16］發(fā)現(xiàn)，由H19派生的miR-675在結(jié)直腸癌中高表達(dá)，可通過下調(diào)其靶基因RB促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖及細(xì)胞集落的形成，發(fā)揮癌基因的作用。miR-218在結(jié)直腸癌組織及細(xì)胞中低表達(dá)，通過下調(diào)BMI-1抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT116及HT29的細(xì)胞增殖，延長細(xì)胞G2期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［17］。miR-133b可通過MET信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制SW620及HT29的增殖，促進(jìn)凋亡發(fā)揮其抑癌作用［18］。本研究發(fā)現(xiàn)HCT116細(xì)胞中，實(shí)驗(yàn)組miR-187*表達(dá)量高于對(duì)照組，提示上調(diào)miR-187*表達(dá)量可提高HCT116細(xì)胞早期凋亡率，發(fā)揮抑癌作用。

綜上所述，miR-187*可通過促進(jìn)凋亡發(fā)揮抑癌作用，但具體信號(hào)通路有待進(jìn)一步研究。miR-187*有望作為一個(gè)新的潛在生物學(xué)標(biāo)志物用于判斷結(jié)直腸癌惡性程度及預(yù)后。

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《中國癌癥雜志》2013年征訂啟事

《中國癌癥雜志》是由國家教育部主管、復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院主辦的全國性腫瘤學(xué)術(shù)期刊，讀者對(duì)象為從事腫瘤基礎(chǔ)、臨床防治研究的中高級(jí)工作者。主要報(bào)道內(nèi)容：國內(nèi)外研究前沿的快速報(bào)道、專家述評(píng)、腫瘤臨床研究、基礎(chǔ)研究、文獻(xiàn)綜述、學(xué)術(shù)討論、臨床病理討論、病例報(bào)道、講座和簡訊等。《中國癌癥雜志》已入選中文核心期刊、中國科技核心期刊及全國腫瘤類核心期刊，并為中國科技論文統(tǒng)計(jì)源期刊，先后被“中國期刊網(wǎng)”、“萬方數(shù)據(jù)——數(shù)字化期刊群”和“解放軍醫(yī)學(xué)圖書館數(shù)據(jù)庫（CMCC）”等收錄。

《中國癌癥雜志》為月刊，大16開，80頁銅版紙（隨文彩圖），每月30日出版，單價(jià)8元，全年96元。國際標(biāo)準(zhǔn)刊號(hào)1007-3639，國內(nèi)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)刊號(hào)CN31-1727/R，郵發(fā)代號(hào)4-575。

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主 編：沈鎮(zhèn)宙

主 任：秦 娟

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郵 編：200032

電 話：021-64188274；021-64175590×3574

網(wǎng) 址：www.china-oncology.com

電子郵件：zgaz@163.com

Down-regulation of microRNA-187* expression in colorectal cancer and its roles in promoting cell apoptosis

LIU Bo, TIAN Yan-feng, ZHAO Zeng-ren, FAN Zhi-bin, ZHANG Li-jing, HE Xin-qi, GAO Li-fei (Department of General Surgery, First Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang Hebei 050031, China)

ZHAO Zeng-ren E-mail: zzr-doctor@163.com

Background and purpose: MicroRNAs (miRNAs) play an important role in tumor biological behavior. miRNAs are down-regulated or up-regulated in various cancer types, triggering abnormal cell differentiation, proliferation and apoptosis. This study was designed to investigate the expression and clinical significance of miR-187* in colorectal cancer (CRC), and further to investigate its roles in promoting cell apoptosis. Methods: The expressions of miR-187* in 40 CRC cases were examined by real-time quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR). The relationship between miR-187* expression and clinical features of CRC was analyzed. HCT116 cells were transfected with a miR-187* mimic and the apoptosis of the transfected cells were examined by flow cytometry (FCM). Results: The expression of miR-187* was down-regulated in CRC tissues 0.165 (0.106, 0.428) compared with those in normal tissues 0.334 (0.211, 0.712) (P＜0.05), especially in mucinous carcinoma and older age CRC (P＜0.05). Transfection of HCT116 cells with a miR-187* mimic up-regulated the expression of miR-187* and increased cell early apoptosis (P＜0.05). Conclusion: The expression level of miR-187* was lower in CRC. miR-187* expression correlates with histological type and age. Transfection of HCT116 cells with a miR-187* mimic accelerates apoptosis of tumor cells, suggesting that miR-187* is a potent tumor suppressor.

Colorectal cancer; microRNA; microRNA-187*; Apoptosis

10.3969/j.issn.1007-3969.2013.09.002

R735.3

：A

：1007-3639(2013)09-0703-06

2013-05-20

2013-08-09）

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No: 81072034)；河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No: C2011206103)；河北省科技計(jì)劃項(xiàng)目(No: 12396105D)。

趙增仁 E-mail:zzr-doctor@163.com