王秋菊崔一喆*孫 鵬朱 雙

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶 163319;2.黑龍江省農(nóng)墾總局北安分局龍門農(nóng)場，五大連池 164145)

小腸堿性磷酸酯酶(alkaline phosphatase，AKP)在細(xì)胞分化、致病菌脂多糖內(nèi)毒素的解毒、維持內(nèi)腔pH，組織內(nèi)磷酸鹽消化和脂肪吸收等方面起重要作用。AKP是細(xì)胞分化作用酶，是小腸腸道消化和吸收功能發(fā)生改變的標(biāo)志酶［1］。小腸AKP的生理功能包括水解磷酸鹽［2］、跨細(xì)胞溶質(zhì)運(yùn)輸［3］以及參與脂肪的吸收［4］等。最近，有研究顯示小腸AKP能夠增加碳酸氫鹽分泌進(jìn)腸道的活力，從而允許酸性的胃的消化物被中和后進(jìn)入小腸，給小腸AKP活力的發(fā)揮創(chuàng)建有利條件［5］。同樣，人們也認(rèn)識到了小腸AKP作為內(nèi)源的解毒因子對腸道黏膜免受致病菌脂多糖危害的防御功能［6－7］，并且這個功能靠腸內(nèi)營養(yǎng)維持著［8］。因此，理解斷奶仔豬小腸AKP消化能力以及細(xì)胞內(nèi)AKP含量的變化將會增進(jìn)腸道生理學(xué)的知識，同時為提高保育期仔豬營養(yǎng)和生長提供理論基礎(chǔ)。

盡管出生后發(fā)育和4～6周齡斷奶仔豬體內(nèi)的AKP活力變化已經(jīng)被報道過［9］，但關(guān)于小腸細(xì)胞內(nèi)AKP活力和含量的研究還未見報道。因此，本試驗旨在研究早期斷奶對仔豬小腸和小腸細(xì)胞內(nèi)AKP活力的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗動物分組與飼養(yǎng)管理

試驗于2010年5月在黑龍江省齊齊哈爾市養(yǎng)豬示范基地進(jìn)行。選取10日齡、體重［(4.48±0.26)kg］相近的“杜×長 ×大”三元雜交仔豬40頭(分別由40頭母豬生產(chǎn))，隨機(jī)分為2組，每組20個重復(fù)，每個重復(fù)1頭仔豬，2組仔豬分別以隨母豬哺乳和早期斷奶方式飼養(yǎng)。試驗期10 d。

哺乳仔豬:在哺乳仔豬舍，隨母豬繼續(xù)哺乳10 d;斷奶仔豬:在保育仔豬舍飼養(yǎng)，飼喂玉米－豆粕型商業(yè)斷奶飼糧10 d，每天07:00、12:00和17:00共飼喂3次，自由飲水。飼糧營養(yǎng)水平參考NRC(1998)，斷奶飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

斷奶仔豬豬舍為封閉式，通風(fēng)良好，水泥地面;采用單欄隔離飼養(yǎng)，每欄1頭仔豬;欄內(nèi)一角上方距地面0.8 m處懸掛紅外取暖燈，燈下地面鋪1塊0.5 m×1 m的吸熱板，以保證仔豬溫暖。

表1 斷奶飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table1 Composition and nutrient levels of the weaner diet(DM basis) %

1.2 試驗樣品采集與處理

飼養(yǎng)試驗結(jié)束后第1天清晨，從各組中隨機(jī)選取12頭仔豬，共計24頭。屠宰后，打開仔豬腹腔，將十二指腸懸韌帶到小腸遠(yuǎn)端的全部小腸都取出，立即用冰生理鹽水沖洗小腸內(nèi)部。將各段小腸分別稱鮮重，并從每部分的中間段取樣，裝到樣品收集管中暫時用液氮冷凍保存［10］。冷凍后的腸段樣品，用研缽在液氮存在的條件下研磨成粉末狀，－80℃冷凍保存。

1.3 樣品制備

組織勻漿:稱取約1.3 g粉末狀的冷凍的小腸組織樣品，按照1 g樣品20 mL勻漿緩沖液的比例，用冷藏的含有蛋白酶抑制劑的勻漿緩沖液將樣品解凍，并用多層勻漿儀將樣品勻漿。勻漿時，每個樣品16 000 r/min勻漿3 min，且每隔1 min，停頓20 s。勻漿后的樣品，稱量并記錄勻漿液的總體積，取2 mL勻漿液樣品于－80℃超低溫冷凍保存。

細(xì)胞內(nèi)質(zhì):根據(jù) Mei等［11］的試驗方法，采用Mg2+－沉淀反應(yīng)和4℃差異離心的方法制備細(xì)胞內(nèi)質(zhì)樣品。具體為組織勻漿液于4℃、2 000×g離心15 min。上清液用1 mol/L MgCl2溶液混合，并將離心管平鋪在冰上，放入水浴振蕩器，低速振蕩15 min，使得混合液中 MgCl2終濃度為10 mmol/L。將混合液于 4℃、2 400×g離心15 min。丟棄上層泡沫層，上清液即為細(xì)胞內(nèi)質(zhì)樣品。稱量細(xì)胞內(nèi)質(zhì)樣品總體積，并從中取2 mL樣品于－80℃冷凍保存。

細(xì)胞頂膜:將余下的細(xì)胞內(nèi)質(zhì)樣品分裝于真空超速低溫離心機(jī)專用離心管中，用含有10 mmol/L MgCl2的重懸浮緩沖液平衡各離心管質(zhì)量，使得各離心管質(zhì)量之差小于0.001 g，達(dá)到平衡。于4℃、19 000×g真空超速離心30 min。吸取上清液，得到的沉淀即為粗制的細(xì)胞頂膜樣品。將沉淀用重懸浮緩沖液重新懸浮到距離離心管管口5 cm處，重新平衡各離心管的質(zhì)量，于4℃、39 000×g真空離心30 min，沉淀為目的細(xì)胞頂膜樣品。將沉淀用懸浮緩沖液重新懸浮成0.5 mL細(xì)胞頂膜懸浮液，全部于 －80℃冷凍保存。

1.4 小腸AKP活力的測定

1.4.1 制備標(biāo)準(zhǔn)曲線

采用對硝基苯酚反應(yīng)測定小腸AKP的活力。首先制備2.5 mmol/L對硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)貯存液，并分別 稀 釋 為 0.521、1.042、3.125、6.250 和10.417 μmol/L的磷酸對硝基苯酚底物溶液。然后用0.25 mol/L NaOH溶液分別稀釋6個梯度的標(biāo)準(zhǔn)品測定液，各標(biāo)準(zhǔn)品管硝基苯酚終濃度為0、6、40、60、90 和120 nmol/L。每個標(biāo)準(zhǔn)濃度做3 個平行。吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液到比色皿中，在分光光度計400 nm讀取吸光度值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.2 樣品測定

用已制得的小腸組織勻漿、細(xì)胞內(nèi)質(zhì)和細(xì)胞頂膜樣品，根據(jù)其蛋白質(zhì)含量，將樣品稀釋至蛋白質(zhì)濃度為1.0 mg/mL，用于AKP活力的測定。具體步驟為:每個樣品做3個平行，移取80 μL稀釋樣品溶液到每個試管中，并放在裝有冰的盒子內(nèi)預(yù)冷。在每個試管中分別加入1.920 mL底物溶液，渦旋混合均勻，37℃水浴孵育樣品20 min。孵育結(jié)束后，在每個試管中加 2 mL 0.5 mol/L NaOH溶液并渦旋混合均勻，停止反應(yīng)。同時做空白對照，在每個空白試驗管中加入2 mL 0.5 mol/L NaOH溶液，再加入80 μL樣品。將所有試管于1 500 r/min離心10 min，以沉淀蛋白質(zhì)。吸取上清液到比色皿中，用紫外分光光度計在400 nm處讀取吸光度值。

AKP活力單位定義為:37℃每分鐘催化產(chǎn)生1 μmol對硝基苯酚的酶量(mg prot)為1個活力單位。

測定結(jié)果根據(jù)米－門二氏方程式酶動力學(xué)基本方程式，通過Fig.P曲線擬合程序獲得AKP活力的動力學(xué)參數(shù)估計。米氏常數(shù)(Km)為最大酶活力(Vmax)達(dá)到1/2時，酶作用底物的濃度;Km越大，酶親和力越小。小腸各腸段AKP的消化能力(Vcap)根據(jù)Weis等［12］的公式進(jìn)行計算。

式中，Vcap為某一腸段AKP的消化能力［mol/(kg BW·d)］，Vmax為該腸段的AKP最大酶活力［μmol/(mg prot·min)］，W 為該腸段的鮮重(g)，P為該腸段的蛋白質(zhì)含量(mg prot/g，鮮重基礎(chǔ))，BW為仔豬的體重(kg)。

1.5 小腸AKP相對含量的測定

1.5.1 總蛋白質(zhì)含量的測定

根據(jù)Bradford分析方法，使用牛血清蛋白(級分IV)作為標(biāo)準(zhǔn)品，測定組織勻漿、細(xì)胞內(nèi)質(zhì)和細(xì)胞頂膜樣品中總蛋白質(zhì)的含量。

1.5.2 免疫印跡(Western-blot)法

制得蛋白質(zhì)含量為1 μg/μL的樣品，以β－肌動蛋白為內(nèi)參，進(jìn)行Western-blot。小腸AKP一抗用兔抗人多克隆抗體，1∶15 000稀釋;β－肌動蛋白一抗用鼠抗人單克隆抗體，1∶20 000稀釋;二抗均用兔抗人免疫球蛋白G，1∶20 000稀釋。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用SAS 9.0軟件中one-way ANOVA及t檢驗進(jìn)行分析。以P＜0.05為差異顯著。結(jié)果采用Fig.P曲線擬合軟件繪制柱狀圖和曲線圖。

2 結(jié)果

2.1 早期斷奶對仔豬生長性能的影響

由表2可見，在10 d的飼養(yǎng)試驗期間，斷奶仔豬的平均日采食量為148.50 g/d，料重比為3.58，與哺乳仔豬相比，斷奶仔豬的末重顯著降低(P＜0.05)，同時斷奶仔豬的平均日增重極顯著低于哺乳仔豬(P＜0.01)。提示早期斷奶對仔豬生長有極強(qiáng)的抑制作用。

表2 仔豬的生長性能Table 2 Growth performance of piglets(n=20)

2.2 早期斷奶對仔豬小腸AKP活力的影響

由表3可見，與哺乳仔豬相比較，斷奶仔豬十二指腸、空腸和回腸Km分別顯著提高了27%、17%和6%(P＜0.05);斷奶仔豬整個小腸 Km顯著提高了17%(P＜0.05);表明斷奶仔豬整個小腸和小腸各段的AKP親和力均顯著降低(P＜0.05)。

斷奶仔豬十二指腸、空腸和回腸AKP最大酶活力較哺乳仔豬分別顯著降低了26%、36%和26%(P＜0.05)，且整個小腸的AKP最大酶活力顯著降低了30%(P＜0.05)。

與哺乳仔豬相比，斷奶仔豬十二指腸、空腸和回腸的AKP消化能力分別顯著降低了39%、22%和20%(P＜0.05)，整個小腸AKP消化能力顯著降低了23%(P ＜0.05)。

小腸各腸段AKP活力動力學(xué)曲線如圖1所示，可見哺乳仔豬各腸段AKP活力均高于斷奶仔豬，且各腸段變化趨勢一致。

表3 仔豬小腸各腸段AKP的Km、最大酶活力和消化能力Table 3 Km，maximal enzyme activity and digestive capacity of alkaline phosphatase in different segments of small intestine of piglets(n=72)

空腸AKP的消化能力約占整個小腸AKP消化能力的72%(表3)。因此，對空腸細(xì)胞內(nèi)質(zhì)和細(xì)胞頂膜中AKP消化能力進(jìn)行了進(jìn)一步的分析，觀察AKP消化能力在空腸中的再分配。

由表4可見，斷奶與哺乳仔豬相比較，空腸細(xì)胞內(nèi)質(zhì)和細(xì)胞頂膜AKP的Km分別顯著提高了48%和49%(P＜0.05)，提示空腸細(xì)胞內(nèi)質(zhì)和細(xì)胞頂膜AKP的親和力均顯著降低(P＜0.05)。

斷奶和哺乳仔豬空腸細(xì)胞頂膜AKP最大酶活力占空腸AKP最大酶活力的90%左右，斷奶沒有顯著影響空腸細(xì)胞內(nèi)質(zhì)AKP的最大酶活力(P＞0.05)，而斷奶仔豬空腸細(xì)胞頂膜AKP最大酶活力比哺乳仔豬顯著降低了10%(P＜0.05)。

斷奶和哺乳仔豬空腸細(xì)胞頂膜中AKP消化能力占空腸AKP消化能力的98%以上。與哺乳仔豬相比，斷奶仔豬空腸AKP的消化能力在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)和細(xì)胞頂膜中分別顯著降低了17%和13%(P ＜0.05)。

由仔豬空腸細(xì)胞內(nèi)質(zhì)和細(xì)胞頂膜中AKP活力動力學(xué)曲線(圖2)可見，斷奶仔豬空腸細(xì)胞內(nèi)質(zhì)和細(xì)胞頂膜中AKP活力均低于哺乳仔豬，且隨底物濃度增加，變化趨勢一致。

圖1 仔豬小腸AKP活力動力學(xué)曲線Fig.1 Kinetic curves of activity of small intestinal alkaline phosphatase of piglets

表4 仔豬空腸細(xì)胞內(nèi)質(zhì)和細(xì)胞頂膜AKP的Km、最大酶活力和消化能力Table 4 Km，maximal enzyme activity and digestive capacity of jejunal intracellular and cell apical membrane-bound alkaline phosphatase of piglets(n=72)

圖2 仔豬空腸細(xì)胞內(nèi)質(zhì)和細(xì)胞頂膜中AKP活力動力學(xué)曲線Fig.2 Kinetic curves of activities of jejunal intracellular and cell apical membrane-bound alkaline phosphatases

2.3 早期斷奶對仔豬空腸AKP相對含量的影響

由圖3可見，從空腸組織勻漿、細(xì)胞內(nèi)質(zhì)和細(xì)胞頂膜中成功鑒定出60 ku的AKP。與哺乳仔豬相比，斷奶仔豬空腸組織勻漿、細(xì)胞內(nèi)質(zhì)和細(xì)胞頂膜的AKP相對含量分別顯著降低了48%、53%和64%(P ＜0.05)。

通過皮爾森相關(guān)性分析得到，哺乳和斷奶仔豬空腸組織勻漿(r=0.51，P=0.023)、細(xì)胞內(nèi)質(zhì)(r=0.41，P=0.032)和細(xì)胞頂膜(r=0.52，P=0.020)的小腸AKP最大酶活力與相對含量均呈顯著正相關(guān)。

圖3 仔豬空腸組織勻漿、細(xì)胞內(nèi)質(zhì)和細(xì)胞頂膜中AKP相對含量Fig.3 Relative content of alkaline phosphatase in jejunal tissue homogenate，intracellular fraction and cell apical membrane of piglets(n=72)

3 討論

斷奶過程伴隨著包括仔豬在內(nèi)的多數(shù)哺乳動物幼仔的采食量下降［13］，且使幼仔經(jīng)受營養(yǎng)和環(huán)境的雙重壓力［14］，因此與正常哺乳的幼仔相比，由于胃腸道未發(fā)育成熟，斷奶導(dǎo)致仔豬生長性能降低。在試驗究中，早期斷奶仔豬顯示出明顯的斷奶應(yīng)激癥狀，斷奶仔豬的平均日采食量為148.50 g/d，低 于 NRC(1998)飼 養(yǎng) 標(biāo) 準(zhǔn) 中240 g/d，斷奶仔豬的平均日增重極顯著低于同期哺乳組仔豬。Gu等［15］研究表明，哺乳動物新生兒在離開它們的母親斷奶時，遭受著巨大的腸道結(jié)構(gòu)和功能的變化，直接影響到仔豬腸道的消化與吸收功能，進(jìn)而影響仔豬的生長發(fā)育。

AKP被稱為經(jīng)典的非特異性金屬酶二聚體。這些酶在自然界廣泛存在于從細(xì)菌到哺乳動物的生物體中，存在于最基本的生命過程中。盡管AKP作用的生理機(jī)制仍然不明確，但無機(jī)磷酸鹽缺乏會誘導(dǎo)許多物種產(chǎn)生AKP(尤其是原核生物)，并且在磷酸鹽代謝中起重要作用。

大多數(shù)生物體中的AKP以二聚體的形式存在，它可以催化磷酸單酯水解生成無機(jī)磷酸鹽和酒精。小腸AKP是一種可以水解磷酸酯的腸刷狀緣蛋白，在解毒致病菌內(nèi)毒素、保持腸腔pH、有機(jī)磷的消化和脂肪的吸收過程中發(fā)揮作用，其基因表達(dá)依賴腸上皮細(xì)胞分化。小腸AKP被認(rèn)為是小腸消化和吸收功能發(fā)生變化的重要標(biāo)記酶［16］。小腸AKP的生理功能包括水解磷酸酯［17］、溶質(zhì)的跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)、參與脂肪的吸收［18－19］。作為腸黏膜內(nèi)源性解毒因子，小腸AKP對于防御腸腔致病細(xì)菌內(nèi)毒素中毒的作用已明確［20－21］，這種作用可以通過腸內(nèi)營養(yǎng)來維持。Fan等［22］研究顯示，仔豬腸上皮細(xì)胞在哺乳到19日齡時完全被替換掉，而空腸上皮細(xì)胞在新生仔豬中的生存期為10 d，仔豬出生后空腸AKP催化活力從哺乳到斷奶呈降低趨勢。但目前為止，關(guān)于斷奶對小腸AKP活力影響的研究很少。

從本試驗結(jié)果可以看出，空腸AKP消化能力占整個小腸AKP消化能力的72%，起主導(dǎo)作用;在空腸中，細(xì)胞頂膜AKP消化能力占空腸AKP消化能力的98%以上。與正常哺乳仔豬相比，早期斷奶對小腸AKP最大酶活力、消化能力和酶親和力都有顯著影響，早期斷奶顯著地降低了仔豬整個小腸腸段AKP的最大酶活力和消化能力。本試驗驗證了早期斷奶仔豬空腸中AKP消化能力、最大酶活力以及小腸AKP的親和力降低，為早期斷奶造成仔豬的易感性和阻礙生長做出理論解釋，即斷奶仔豬易感染腸道疾病的原因之一是空腸AKP的保護(hù)作用降低。

本試驗的主要目的是研究早期斷奶仔豬與哺乳仔豬小腸AKP活力的差異。結(jié)果顯示，斷奶顯著降低了仔豬小腸AKP消化能力和空腸前端的AKP最大酶活力。目前關(guān)于斷奶對小腸AKP活力和其基因表達(dá)影響的研究報道很少，本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)斷奶仔豬小腸AKP最大酶活力和消化能力都降低，與Miller等［23］的研究結(jié)果相反，該研究結(jié)果顯示3周齡和5周齡斷奶的仔豬小腸AKP活力沒有顯著變化。2點原因可以解釋為什么本試驗與該研究結(jié)果不一致。第一，斷奶時間不同，本試驗仔豬在10日齡斷奶10 d后測定，Miller等［23］的研究是在仔豬5周齡時斷奶后5 d測定;第二，本試驗測定了小腸AKP的最大酶活力，而Miller等［23］的研究中只用了一個 AKP的底物濃度(1.5 mmol/L)。因此，本試驗測定的小腸AKP特定活力較Miller等［23］研究的最大酶活力低很多。圖1和圖2可以證明比最大酶活力低時測定的小腸AKP特定活力受到底物濃度的影響，而小腸AKP的消化能力和含量并不受底物濃度的影響。

Western-blot分析證實仔豬空腸前端細(xì)胞內(nèi)質(zhì)和細(xì)胞頂膜中的小腸AKP分子質(zhì)量大約為60 ku，比人類腸道中的AKP分子質(zhì)量?。?4］。在新出生的小鼠空腸中檢測到小腸AKP分子質(zhì)量約為65 ku［25］。小鼠小腸AKP的編碼mRNA的無細(xì)胞翻譯產(chǎn)生2種小腸AKP單體，分子質(zhì)量分別為62和65 ku［26］。理論上，空腸前端細(xì)胞內(nèi)質(zhì)和細(xì)胞頂膜中AKP的相對含量是小腸AKP生物合成和運(yùn)輸以及降解的凈平衡［27］。哺乳和斷奶仔豬，腸細(xì)胞頂膜的小腸AKP的最大酶活力大部分(98%)是空腸前段AKP的活力，暗示著在細(xì)胞中有很小的膜內(nèi)AKP蛋白池。因此，早期斷奶仔豬空腸前段AKP含量的下降主要是由于小腸AKP的蛋白質(zhì)從頭合成降低了，這仍需要從體外對小腸AKP進(jìn)行標(biāo)記和生物合成來繼續(xù)研究和確定。另一方面，與早期斷奶仔豬相比，哺乳仔豬的空腸前段AKP的親和力也有顯著變化。有研究顯示，新出生仔豬空腸AKP親和力從哺乳到斷奶后期是逐漸降低的［23］。小腸AKP親和力、最大酶活力和含量的在空腸前段的改變顯示，早期斷奶改變了小腸AKP的含量并降低了它的親和力。這個小腸AKP親和力的變化主要是由小腸AKP的糖基化的發(fā)生導(dǎo)致［22］。因此，空腸AKP最大酶活力和消化能力的降低是由小腸中AKP含量和親和力降低的聯(lián)合作用導(dǎo)致的。再者，已知新生兒在正常哺乳情況下，腸上皮細(xì)胞在出生19 d后完全更換，且新生兒空腸上皮細(xì)胞的壽命為10 d，可以推斷，早期斷奶通過影響腸上皮細(xì)胞更換過程中小腸AKP的蛋白質(zhì)合成和轉(zhuǎn)運(yùn)來降低小腸AKP的消化能力。小腸AKP在腸道中有重要作用，包括解毒作用、維持腔內(nèi)pH，消化有機(jī)磷酸鹽和吸收脂肪，小腸AKP的消化能力、活力降低就會伴隨著小腸AKP含量的降低，也就如本試驗的結(jié)果所示。本試驗結(jié)果為研究小腸中小腸AKP活力的調(diào)控機(jī)制提供了信息，也許可以用來解釋早期斷奶仔豬對腸道疾病和生長受阻易感性。

4 結(jié)論

總之，小腸AKP在小腸上皮黏膜中起重要作用，早期斷奶可降低小腸AKP活力、親和力、消化能力及含量，使仔豬承受腹瀉和生長受阻的風(fēng)險。

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