牟 新 杭州市紅十字會醫(yī)院 杭州 310003

·學(xué)術(shù)探討·

中醫(yī)證候?qū)嵸|(zhì)與表觀遺傳學(xué)相關(guān)性初探

牟 新 杭州市紅十字會醫(yī)院 杭州 310003

表現(xiàn)遺傳學(xué) 中醫(yī)證候 理論探討

辨證論治是中醫(yī)學(xué)的特色之一，是構(gòu)成中醫(yī)理論體系的重要組成部分，是臨床醫(yī)療實踐準(zhǔn)則，在臨床診療過程中，方從法出，法隨證立，可見“證候”是診療過程的核心內(nèi)容，是立法遣藥組方的依據(jù)，所以正確的辨證在臨床工作中有著十分重要的意義。但是，因為中醫(yī)有著獨(dú)特的理論體系，所以疾病的診療過程與西醫(yī)不完全相同，它是通過對疾病表現(xiàn)出來的紛繁復(fù)雜現(xiàn)象進(jìn)行客觀分析，通過“審證求因”，進(jìn)行個體化辨證治療。這種個體化診療表現(xiàn)在不同醫(yī)生對疾病的病因病機(jī)的把握上，正是由于這種辨證個體之間的差異導(dǎo)致了研究進(jìn)展的滯緩。

建國以來，中醫(yī)的基礎(chǔ)研究引領(lǐng)著中醫(yī)臨床學(xué)科的發(fā)展和創(chuàng)新，其中對“證候”實質(zhì)的探討方興未艾，相繼開展了證候規(guī)范化、證的實質(zhì)和證的動物模型的研究，在此基礎(chǔ)上還引入現(xiàn)代流行病學(xué)和醫(yī)學(xué)統(tǒng)計學(xué)等研究方法對疾病的證候規(guī)律和演變進(jìn)行了大量臨床研究，也取得了不少引人注目的研究成果。然而，對中醫(yī)證型的分布和中醫(yī)“證”的實質(zhì)缺乏系統(tǒng)研究，為辨證的客觀化、標(biāo)準(zhǔn)化帶來了一定的困難，制約了中醫(yī)臨床研究水平和療效的進(jìn)一步提高?？梢?，開展證候的研究仍有重大的現(xiàn)實意義，對中醫(yī)的學(xué)術(shù)發(fā)展也將有重要的影響。

王永炎院士曾提出證候具有“內(nèi)實外虛”、“動態(tài)時空”和“多維界面”的特點(diǎn)［1］，目前證候?qū)W研究主要集中在“證候”本質(zhì)研究和“證候”規(guī)范化研究兩個方面。

1 證候?qū)嵸|(zhì)的研究

證候?qū)嵸|(zhì)的研究是中醫(yī)證候規(guī)范化的基礎(chǔ)，它是中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究的主要領(lǐng)域，是運(yùn)用包括分子生物學(xué)、現(xiàn)代流行病學(xué)、醫(yī)學(xué)統(tǒng)計學(xué)、遺傳學(xué)在內(nèi)的現(xiàn)代自然科學(xué)多學(xué)科理論、方法與手段，在中醫(yī)傳統(tǒng)理論指導(dǎo)下探索中醫(yī)證候?qū)嵸|(zhì)的科學(xué)研究，對于將中醫(yī)藥理論用現(xiàn)代自然科學(xué)的方式方法進(jìn)行闡明有著舉足輕重的作用。

不同的疾病會產(chǎn)生不同的證候，同一疾病的不同發(fā)展階段其證候也不盡相同，正如現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為的同一種疾病的不同發(fā)展階段，其生化、病理學(xué)指標(biāo)也隨之進(jìn)展一樣，相同的證候也可能存在共同的物質(zhì)基礎(chǔ)，而這種物質(zhì)基礎(chǔ)或許能反應(yīng)在基因、細(xì)胞、分子等微觀水平上。因此，通過對疾病的生理、病理、生化等方面的客觀指標(biāo)進(jìn)行分析，可以進(jìn)一步揭示證候的內(nèi)在機(jī)制，并且可以把這些客觀指標(biāo)用于疾病證候診斷的必要補(bǔ)充。

劉鶯［2］認(rèn)為，基因組學(xué)與中醫(yī)學(xué)兩個學(xué)科在思維方法上的趨近特征，顯示了研究思路與方法相互滲透的可能性。通過中醫(yī)證候?qū)W與致?。ㄒ赘校┗蜓芯浚兄诜e極預(yù)防證候的轉(zhuǎn)變。通過中醫(yī)證候表達(dá)譜的研究，可以提高辨證的可信度和準(zhǔn)確度，對闡明基因與證之間的聯(lián)系，對認(rèn)識疾病的發(fā)生機(jī)制、預(yù)測疾病的轉(zhuǎn)歸都會發(fā)揮重要作用。劉為民［3］提倡將蛋白質(zhì)組學(xué)引入中醫(yī)證候分類及證候演變規(guī)律的研究中，認(rèn)為就分子水平而言，證候不一則基因表達(dá)譜也不一樣，證的本質(zhì)是基因型及其表達(dá)，例如基因及其 mRNA、蛋白質(zhì)水平差異是癥狀和體征變化的分子基礎(chǔ)。李戎等［4］認(rèn)為利用基因芯片技術(shù)，對不同個體的“證”狀態(tài)的基因組進(jìn)行掃描，繪出不同證的基因表達(dá)譜、通過計算機(jī)分析來建立“證”相關(guān)譜，可望從基因水平為“證候”的規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化和現(xiàn)代化研究提供可能。呂仁和等［5］將臨床表現(xiàn)和內(nèi)生肌酐清除率（Ccr）結(jié)合進(jìn)行積分定量，擬定了慢性腎炎（前期）中醫(yī)辨證和療效評定規(guī)范方案。徐志偉等［6］為探索實熱證、虛熱證本質(zhì)，對甲狀腺超微結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，熱證的大鼠甲狀腺激素水平變化與甲狀腺組織上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化呈平行關(guān)系。

鄭洪新［7］認(rèn)為，宏觀與微觀結(jié)合研究中醫(yī)證候病機(jī)需要特別注重保持中醫(yī)特色，發(fā)揮中醫(yī)優(yōu)勢；立足于宏觀的中醫(yī)證候病機(jī)研究方法，進(jìn)行微觀、超微研究；認(rèn)識普遍性，探求特殊性；采用定性、定量相結(jié)合的綜合集成研究方法；注重掌握相對的、辨證的、動態(tài)的觀察分析綜合病理機(jī)制的方法，對時間、空間、條件等因素加以嚴(yán)格限制，恪守對照、均衡、隨機(jī)、重復(fù)四大原則，對研究結(jié)果不能片面地加以絕對化或過分追求“理想化”。郭蕾等［8］認(rèn)為證候與理化指標(biāo)之間的非線性關(guān)系主要表現(xiàn)為非獨(dú)立性方面。目前尚未找到具有相對排他的某一或某些理化指標(biāo)可以作為某一證候的判斷標(biāo)準(zhǔn)。李喜悅等［9］認(rèn)為血漿蛋白質(zhì)組學(xué)是對血漿中某一時段的全部蛋白質(zhì)的表達(dá)和功能模式進(jìn)行研究，可以在以往證候研究基礎(chǔ)上，對不同證候血漿進(jìn)行分析，找出與其相關(guān)的一過性、階段性和持續(xù)性變化的功能蛋白，并很可能成為中醫(yī)者長期以來尋找的證實質(zhì)。李梢［10］從網(wǎng)絡(luò)的角度展開對證候生物學(xué)基礎(chǔ)的探索，建立了從“表型網(wǎng)絡(luò)-生物分子網(wǎng)絡(luò)-藥物網(wǎng)絡(luò)”理解病證方關(guān)系的研究框架，由此進(jìn)一步提出證候生物分子網(wǎng)絡(luò)標(biāo)志的構(gòu)想，并進(jìn)行了寒證與熱證的案例研究。簡維雄等［11］等通過對代謝組學(xué)與中醫(yī)證候整體性關(guān)系、時空性關(guān)系，以及結(jié)果分析時降維的關(guān)系比較，認(rèn)為代謝組學(xué)與中醫(yī)證候在分析問題及解決問題方面具有相同的思維。王忠等［12］認(rèn)為證候是多種基因參與的，且已經(jīng)超過了人體正常的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)能力，是處于絡(luò)病狀態(tài)的癥狀群。基因的差異性是證候之間差別的物質(zhì)基礎(chǔ)，又是確定其所代表的癥狀在疾病證候中重要性、貢獻(xiàn)度的依據(jù)。申維璽［13］認(rèn)為中醫(yī)證的本質(zhì)是細(xì)胞因子。

從上述研究我們欣喜的看到，隨著一些新理論（如系統(tǒng)論、控制論、信息論和耗散結(jié)構(gòu)理論、證候晶體學(xué)等）的提出和新方法（蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、基因芯片、量表和問卷、隱結(jié)構(gòu)分析）的應(yīng)用，使得證候?qū)嵸|(zhì)的跨學(xué)科研究成為主流的研究方法。因此，在汲取現(xiàn)代研究成果的同時，通過進(jìn)一步研究、完善證候宏觀標(biāo)準(zhǔn)，這無論是對于促進(jìn)證候標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)范化、客觀化，還是證的本質(zhì)的研究都具有十分重要的意義。

“證候”本質(zhì)研究雖然隨著實驗室檢測手段的不斷發(fā)展，目前從不同角度及層次發(fā)現(xiàn)了部分與“證”相關(guān)的實驗室檢測指標(biāo)，認(rèn)為這些指標(biāo)可用于揭示中醫(yī)“證”的本質(zhì)。但是對證候?qū)嵸|(zhì)的研究進(jìn)行整體綜合考察，目前尚不能找到某一個或某一組對于某一個證候有非常特異性的客觀指標(biāo)。我們認(rèn)為，作為疾病發(fā)展過程中的某一階段的病理概括，證候除了受到先天體質(zhì)因素的影響之外，更重要的是受到了環(huán)境、生活習(xí)慣等后天因素的影響，而表觀遺傳學(xué)恰恰是研究這些因素對疾病影響的一門學(xué)科，因此我們試圖探討兩者之間是否存在關(guān)聯(lián)性。

近年來，隨著表觀遺傳學(xué)（epigenetics）研究的深入，顯示環(huán)境和個人的選擇可以影響基因而不涉及基因編碼的改變。這與證候的動態(tài)性和受后天環(huán)境因素影響較大的特點(diǎn)較為貼近。因此，我們通過一個角度探討中醫(yī)證候的多樣化和表觀遺傳學(xué)的相關(guān)性，試圖揭示證候?qū)W理論的實質(zhì)。

2 表觀遺傳學(xué)研究進(jìn)展

遺傳學(xué)告訴我們，通過基因結(jié)構(gòu)的改變會可以引起生物體表現(xiàn)型（phenotype）的改變，而且這種改變可以從上一代傳到下一代。而表觀遺傳學(xué)則是指基于非基因序列改變所致基因表達(dá)水平變化，基因表達(dá)的改變也可以導(dǎo)致可遺傳的表現(xiàn)型變化如DNA甲基化和染色質(zhì)構(gòu)象變化等，這種表現(xiàn)型變化沒有直接涉及基因的序列信息。于是，遺傳學(xué)的研究又開辟了一個新的領(lǐng)域—表觀遺傳學(xué)。

表觀遺傳學(xué)雖然是在上世紀(jì)80年代后期就已經(jīng)逐漸興起，但卻是在2000年以后才真正受到廣泛重視并取得了一系列進(jìn)展，目前已經(jīng)成為當(dāng)今生命科學(xué)研究的前沿和熱點(diǎn)。1999年在歐洲成立了人類表觀基因組協(xié)會，把解析人類DNA甲基化譜以及進(jìn)行“基因組的表觀遺傳可塑性研究計劃”作為主要任務(wù)，并擬繪制不同組織類型和疾病狀態(tài)下的人類基因組甲基化可變位點(diǎn)的圖譜［14］。

目前，表觀遺傳學(xué)研究主要集中在DNA的甲基化、組蛋白密碼和染色質(zhì)重塑、非編碼RNA調(diào)控等方面，而DNA的甲基化是基因組DNA的一種主要表觀遺傳修飾形式。在脊椎動物中，DNA啟動子區(qū)CpG島成簇狀存在，它是DNA發(fā)生甲基化的主要位點(diǎn)，所以研究DNA甲基化常與CpG島相關(guān)聯(lián)，目前對DNA啟動子區(qū)CpG島異常甲基化的研究是表觀遺傳學(xué)的一個熱點(diǎn)［15-16］。

Srinivasan等［17］研究發(fā)現(xiàn)，對新出生的雌性幼鼠采用人工喂養(yǎng)高糖牛奶的方法，可以導(dǎo)致慢性高胰島素血癥和成年發(fā)病的肥胖，而且這種高胰島素血癥和肥胖表現(xiàn)型可以繼續(xù)傳給它們的下一代，但是通過輕微的飲食控制就可以逆轉(zhuǎn)甚至也可以在它們的后代中預(yù)防這種表現(xiàn)型的發(fā)生。因此，有研究者提出從某種意義上講，2型糖尿病也一種表觀遺傳性疾病［18］。

而在糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制方面，有研究顯示，高同型半胱氨酸血癥、高血脂、炎癥和氧化應(yīng)激等因素都可促進(jìn)DNA的異常甲基化，從而導(dǎo)致糖尿病腎病的發(fā)生［19-21］。而且糖尿病腎病和“代謝記憶效應(yīng)”有關(guān)，基因與環(huán)境的關(guān)系可以導(dǎo)致染色質(zhì)的特異變化，而早期強(qiáng)化治療控制血糖有長期的代謝性記憶效應(yīng)及減少糖尿病腎病和其他糖尿病并發(fā)癥的發(fā)病率，其機(jī)制可能和表觀遺傳學(xué)有關(guān)［22-23］。而在1型糖尿病患者中，有研究者也發(fā)現(xiàn)DNA的甲基化和糖尿病腎病患者的年齡、起病時間和性別相關(guān)，而且證實了19個CpG島和糖尿病腎病進(jìn)展相關(guān)［24］。有研究者對出現(xiàn)慢性終末期腎病的糖尿病腎病患者和單純的2型糖尿病患者的基因甲基化進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)了187（21%）個候選基因存在差異［25］。

3 中醫(yī)證候?qū)嵸|(zhì)與表觀遺傳學(xué)

我們曾對360例2型糖尿病和糖尿病腎病患者進(jìn)行橫斷面研究［26-27］，對糖尿病腎病人群不同體質(zhì)類型、不同證候及其與TGF-β1基因T869C多態(tài)性的內(nèi)在關(guān)聯(lián)及其交互作用進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)糖尿病腎病的部分體質(zhì)和TGF-β1基因T869C基因多態(tài)性有一定的相關(guān)性［28］。而我們對糖尿病腎病患者的證候與TGF-β1基因T869C多態(tài)性進(jìn)行二分類logistic回歸分析，發(fā)現(xiàn)最后無相關(guān)證候進(jìn)入回歸模型。我們認(rèn)為這與證候的動態(tài)性和受后天環(huán)境因素影響較大有關(guān)，因此，有必要引入表觀遺傳學(xué)的研究方法進(jìn)一步探究證候的實質(zhì)，見圖1。

圖1 中醫(yī)體質(zhì)學(xué)和證候?qū)W的物質(zhì)基礎(chǔ)

從以上研究可看出目前中醫(yī)在證候?qū)嵸|(zhì)的研究方面，已經(jīng)取得了許多進(jìn)展，但由于證候的復(fù)雜性，很難從微觀的角度尋找診斷某一證候的實驗室指標(biāo)。隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，以期從表觀遺傳學(xué)有所突破。

基于此，我們提出表觀遺傳學(xué)是中醫(yī)證候多樣性的部分物質(zhì)基礎(chǔ)這一假說，認(rèn)為以基因多態(tài)性為代表的遺傳學(xué)改變是中醫(yī)體質(zhì)易感性的物質(zhì)基礎(chǔ)，發(fā)病后出現(xiàn)的證候多樣性則和表觀遺傳學(xué)改變更為相關(guān)，不同發(fā)病途徑的DNA甲基化導(dǎo)致了不同的證候，而這恰恰豐富了疾病的發(fā)生不外“先天稟賦和后天失養(yǎng)”這一中醫(yī)病因?qū)W的內(nèi)容。這些表觀遺傳學(xué)的微觀指標(biāo)可以作為中醫(yī)證候宏觀辨證的必要的補(bǔ)充，對探究證候的實質(zhì)提供了新的理論思路。

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2012-12-12

國家自然科學(xué)基金資助（No.81273623）