何正言 梅浩

膝骨關(guān)節(jié)炎(Knee Osteoarthritis，KOA)是一種常見的關(guān)節(jié)軟骨退變疾病，其主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、晨僵、腫脹和進(jìn)行性致畸。KOA的病變主要在于軟骨的退行性改變，而軟骨的退行性改變受各種細(xì)胞信號通路及因子的調(diào)控，其中Hippo-YAP信號通路是近年來研究的熱點。目前的研究表明，Hippo通路的發(fā)現(xiàn)源自于1995年果蠅基因突變表型Wts，2002年發(fā)現(xiàn)了 Hippo 通路的三個成員:Salvador、YAP 和 Mats［1］。目前的研究證明［2］，Hippo信號通路是一條較為保守的信號通路，另外有研究證明［3］Hippo信號通路可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和凋亡，檢索國內(nèi)外文獻(xiàn)均為發(fā)現(xiàn)Hippo信號通路在骨關(guān)節(jié)炎中的研究報道。本文將通過探討骨關(guān)節(jié)炎與Hippo信號通路的關(guān)系，了解Hippo信號通路在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病中的相關(guān)機制，為骨關(guān)節(jié)炎的早期診斷和病情判斷提供臨床實驗數(shù)據(jù)，并且為進(jìn)一步的治療和預(yù)防提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 實驗對象 ①病例選擇:所有研究對象均來自2010年2月至2012年8月韶關(guān)市第一人民醫(yī)院骨科。實驗組膝關(guān)節(jié)KOA患者71例，女32，男39例，平均年齡(67±12)歲(43～79歲)，以上所有患者均經(jīng)過臨床及關(guān)節(jié)鏡確診，并且符合1991年美國風(fēng)濕協(xié)會制定的Altman診斷標(biāo)準(zhǔn)。對照組為我院健康體檢者29例，無KOA病史，膝關(guān)節(jié)透視檢查正常，女13例，男16例，平均年齡(45±26)歲(26～78歲)。所有試驗對象均在行關(guān)節(jié)鏡檢查前行關(guān)節(jié)穿刺，并與其簽署知情同意書。②實驗標(biāo)本:兩組的滑液均在行膝關(guān)節(jié)腔穿刺時留取，在抽取關(guān)節(jié)滑液時，先用1 ml的生理鹽水沖洗關(guān)節(jié)腔，待沖洗完全后抽取1.5 ml。留取的關(guān)節(jié)滑液標(biāo)本均離心后取上清，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 材料和方法 ①主要儀器:普通冰箱(中國海爾)，HHW電熱恒溫水浴箱(金壇市醫(yī)療器械廠)，ELX800酶標(biāo)分析儀(美國Bio-Tec公司)。②主要試劑:Hippo-YAP抗體試劑盒購自Abcam公司，編號:ab124474。抑制凋亡蛋白BCL-2抗體試劑盒購自上海恒斐生物科技有限公司，編號:BY-5134R。③ELISA試驗方法:將96孔板最上面一排的8孔作為標(biāo)準(zhǔn)孔，反復(fù)對倍稀釋各孔，最后一個孔作為空白孔，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線;加入待測樣品100 μl，37℃反應(yīng)90 min;0.01 m PBS洗板三次，濾紙印干;加入 Hippo-YAP-1(BCL-2)一抗 100 μl，37℃反應(yīng)60 min;0.01 m PBS洗板三次，每次浸泡三分鐘，濾紙印干;加入酶標(biāo)液100 μl，37℃反應(yīng) 30 min;0.01 m PBS 洗板五次，每次浸泡兩分鐘，濾紙印干;加入底物 TMB90 μl，置37℃暗處反應(yīng)5～10 min;每孔加入一滴終止液混勻，當(dāng)藍(lán)色轉(zhuǎn)為黃色時上機檢測;酶標(biāo)儀設(shè)定450nm處測定吸光值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均輸入計算機，用SPSS 19.0版本軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P＜0.05確定為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

實驗組與對照組的滑液中YAP與BCL-2的表達(dá)水平作單因素方差分析，結(jié)果見表1。YAP的實驗組與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義P＜0.01，KOA患者的滑液中YAP的水平顯著高于對照組。BCL-2的實驗組與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義P＜0.01，KOA患者的滑液中BCL-2的水平顯著低于對照組。

實驗組中YAP與BCL-2水平作Spearman相關(guān)分析，相關(guān)系數(shù)為r=0.921(P＜0.01)，兩者呈正相關(guān)。

表1 關(guān)節(jié)滑液中PD-1及NO檢測結(jié)果()

表1 關(guān)節(jié)滑液中PD-1及NO檢測結(jié)果()

注:*與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)

組別 例數(shù) YAP(pg/ml) BCL-2(pg/ml)實驗組 71 42.18±133.54* 33.13±19.21*對照組29 254.12±28.12 194.11±21.61

3 討論

膝骨關(guān)節(jié)炎在中老年人疾病中較為常見，其發(fā)病原因與關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的退變、凋亡有關(guān)，軟骨細(xì)胞在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過程中的變化受內(nèi)環(huán)境中各種細(xì)胞信號通路及細(xì)胞因子的影響。骨關(guān)節(jié)炎的病理生理變化主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨組織的合成與分解代謝失衡，如軟骨細(xì)胞過度成熟而導(dǎo)致骨贅的形成、關(guān)節(jié)間隙變小，另一方面軟骨細(xì)胞破壞過多、退化及萎縮而致關(guān)節(jié)滑液少、軟骨彈性低及關(guān)節(jié)僵硬［4］。本文以下將對滑液中檢測到的Hippo-YAP與BCL-2表達(dá)水平在KOA中的可能機制及它們的相關(guān)關(guān)系展開討論。

3.1 Hippo-YAP與KOA的關(guān)系 Hippo-YAP信號通路是一條較為保守的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其中YAP蛋白是銜接Hippo信號通路上下游因子的重要蛋白，YAP主要是負(fù)責(zé)從細(xì)胞膜到細(xì)胞核的信號傳導(dǎo)［5］。有研究表明在腫瘤細(xì)胞中抑制Hippo信號通路可以使得腫瘤細(xì)胞過度增殖分化，并且其中檢測到Y(jié)ki蛋白高表達(dá)，而在正常細(xì)胞中抑制Hippo信號通路可使得細(xì)胞增殖緩慢，說明Hippo信號通路對細(xì)胞增殖起正調(diào)控的作用，而對腫瘤細(xì)胞起篩選的抑制作用［6］。YAP是Hippo通路的主要效應(yīng)因子，近年來的研究表明YAP對細(xì)胞起促進(jìn)增殖分化的作用［7］。本實驗研究中我們發(fā)現(xiàn)實驗組KOA患者膝關(guān)節(jié)滑液較對照組顯著高表達(dá)YAP蛋白，提示了KOA的發(fā)病過程中YAP高表達(dá)，其可能是病程中YAP介導(dǎo)了軟骨細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞程序性死亡，文獻(xiàn)中表明Hippo通路的YAP蛋白與細(xì)胞的增殖呈正相關(guān)［8］，而本研究中實驗組的較老的兩例患者的 YAP較低(79歲 =60.73 pg/ml，77歲 =61.11 pg/ml)，其可能是原因是骨關(guān)節(jié)炎早期時軟骨細(xì)胞主要表現(xiàn)過度成熟、增生及骨贅的形成，而晚期時表現(xiàn)為軟骨退化、萎縮。KOA患者的滑液中BCL-2的水平顯著低于對照組，而在正常人中表達(dá)較高，其可能的原因是BCL-2在凋亡與抗凋亡平衡中起抗凋亡作用，與文獻(xiàn)相符［9］。

3.2 Hippo-YAP信號通路與凋亡的關(guān)系 Hippo-YAP信號通路主要通過接受細(xì)胞膜上FAT4膜蛋白受體上的信號，從而通過各種膜蛋白傳導(dǎo)給YAP，YAP進(jìn)而將抗凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)給細(xì)胞核，而細(xì)胞核指導(dǎo)各種抗凋亡因子的作用，如BCL-2、AKT、caspase-3等［10］。本研究的結(jié)果表明，KOA 患者的滑液中BCL-2的濃度顯著低于對照組，提示了KOA的發(fā)病過程中關(guān)節(jié)滑液BCL-2濃度顯著降低。KOA患者滑液里YAP與BCL-2呈正相關(guān)，近年來的研究證明BCL-2為抗凋亡因子之一，本研究發(fā)現(xiàn)YAP與BCL-2呈正相關(guān)關(guān)系，進(jìn)一步說明了YAP蛋白可能為抗凋亡因子，因此YAP可能是KOA發(fā)病過程中促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨凋亡的重要因子。

3.3 展望 本實驗因為晚期樣本量的限制未將實驗組的早中期和晚期的患者進(jìn)行分組研究，而進(jìn)一步的實驗可對形成骨贅的骨關(guān)節(jié)炎和軟骨退變的骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)行分組研究Hippo-YAP信號通路，其可進(jìn)一步的研究骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病中Hippo-YAP信號通路的機制。綜上所述，Hippo-YAP信號通路可能是軟骨細(xì)胞的抗凋亡過程，深入探討Hippo-YAP信號通路在骨關(guān)節(jié)炎中的各種促進(jìn)機制將有可能建立骨關(guān)節(jié)炎新的治療靶點。

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