張 燕

（新疆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，烏魯木齊 830002）

藥物作為一種特殊商品，由于其和人類的健康安全息息相關(guān)，國家制定了相應(yīng)的藥物安全性評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)以確保新藥的研發(fā)過程在標(biāo)準(zhǔn)、系統(tǒng)的監(jiān)管下科學(xué)的進(jìn)行。國家食品藥品監(jiān)督管理局（SFDA）于2003年正式發(fā)布《藥物非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范》[1]，規(guī)范中明確規(guī)定在新藥的研發(fā)過程必須包括安全性評價(jià)內(nèi)容主要涉及到藥品臨床前試驗(yàn)研究（應(yīng)用藥品非臨床安全性研究質(zhì)量管理規(guī)范GLP，Good Laboratory Practice）、臨床小樣本人體試驗(yàn)研究（應(yīng)用藥品臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范GCP，Good Clinical Practice）、新藥上市后的不良反應(yīng)監(jiān)測（國家監(jiān)管）等。GLP是國際通用的臨床前藥品安全性評價(jià)規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)[2]，我國在1999年頒發(fā)了我國的《藥物非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范》（GLP）[3]。2007年SFDA經(jīng)修訂發(fā)布了最新的《GLP認(rèn)證管理辦法》[4]。非臨床安全性評價(jià)包括安全性藥理（一般藥理）、單次給藥毒性（急性毒性）、重復(fù)給藥毒性（長期毒性）、遺傳毒性、生殖毒性、致癌性、依賴性、特殊毒性（過敏性、局部刺激性、溶血性）等方面的評價(jià)。本課題對天然來源的、具有抗腫瘤活性的有效成分作為先導(dǎo)化合物而合成新型β咔啉衍生物藥物（代號：HMD）進(jìn)行急性毒性研究。本次實(shí)驗(yàn)以經(jīng)靜脈注射給藥的方式在小鼠上進(jìn)行HMD急性毒性實(shí)驗(yàn)，得出HMD藥物急性毒性的基本參考數(shù)據(jù)，為HMD應(yīng)用于肝癌裸鼠移植瘤模型的抑瘤實(shí)驗(yàn)提供基本數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 環(huán)境設(shè)施

新疆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心SPF屏障實(shí)驗(yàn)室（SYXK（新）2011-0002），溫度變化范圍為20～23℃，濕度變化范圍為40%～50%，室內(nèi)照明設(shè)置為12L：12D（光照時(shí)間為10：00～22：00，黑暗時(shí)間為22：00～10：00）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與藥物

新疆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供4～6周齡（18～22 g）昆明小鼠雌雄各半75只（SCXK（新）2011-0001）。動(dòng)物飼料為本中心自產(chǎn)經(jīng)Co60放射滅菌處理的全價(jià)小鼠飼料，飲水通過實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飲用水處理器（杭州永潔達(dá)凈化科技有限公司）處理后加鹽酸酸化，飲用水pH值為3.0～3.5，每周更換1～2 次水瓶和籠具。

藥物HMD，呈白色粉末狀，室溫下水溶性好，溶液透明。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 預(yù)試驗(yàn)[5]

將60只雌雄各半昆明小鼠，雌鼠雄鼠分別隨機(jī)分為六組，每組5只。以100 mg/kg、50 mg/kg、25 mg/kg、12.5 mg/kg、6.25 mg/kg、3.13 mg/kg HMD濃度注射體積0.2ml/20g小鼠體重單次靜脈注射給藥，觀察3日內(nèi)昆明小鼠死亡反應(yīng)，預(yù)測HMD小鼠急毒反應(yīng)的各項(xiàng)劑量值。

1.3.2 藥物HMD半數(shù)致死劑量（LD50）的測定

根據(jù)急毒預(yù)實(shí)驗(yàn)測定劑量結(jié)果，確定出急毒試驗(yàn)的最小致死劑量（LD100）和最大耐受量（LD0），查照分組數(shù)與劑量比值表[6]確定受試劑量組及劑量梯度。取KM小鼠分組后按設(shè)計(jì)劑量濃度以靜脈注射給藥1次，注射體積0.2 ml/20g小鼠體重。連續(xù)觀察期為14 d，分別記錄每組動(dòng)物的外觀、體征（呼吸、運(yùn)動(dòng)、驚厥、反射和眼瞼）和死亡情況等[7]。根據(jù)小鼠的死亡情況，采用Bliss法計(jì)算HMD的LD50值。在14 d觀察期結(jié)束后，每只實(shí)驗(yàn)小鼠均進(jìn)行解剖，仔細(xì)觀察心、肝、脾、肺、腎、胃、腸、子宮/卵巢等主要臟器，若發(fā)現(xiàn)有組織器官發(fā)生異常改變時(shí)，必須進(jìn)行病理學(xué)檢查。

1.4 數(shù)據(jù)處理

記錄正式急性毒性實(shí)驗(yàn)的各組動(dòng)物只數(shù)、藥物劑量、死亡時(shí)間、死亡數(shù)，經(jīng)Bliss法軟件測定得出HMD的LD50值。

2 結(jié)果

2.1 急性毒性實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果

急性毒性試驗(yàn)中，昆明小鼠在靜脈給藥約1.5 h后，出現(xiàn)小鼠中樞神經(jīng)極度興奮狀態(tài)，如叫聲異常、全身性抽搐、跳躍隨后出現(xiàn)抑制至死亡。其間小鼠出現(xiàn)眼部充血、大小便失禁及流涎現(xiàn)象。14 d觀察期后，全部存活小鼠處死剖檢，肉眼檢查重要臟器（心、肝、脾、肺、腎、胃、腸、卵巢/睪丸等）未見有明顯異常病理形態(tài)改變。

2.2 急性毒性預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果見表1。根據(jù)表1的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)大致得出HMD的最小致死劑量（LD100）約為25 mg/kg和最大耐受量（LD0）約為3.13 mg/kg。

表1 HMD-272對小鼠靜脈給藥急性毒性預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 HMD半數(shù)致死量（LD50）的測定

由預(yù)實(shí)驗(yàn)得出LD100：LD0=25mg/kg：3.13mg/kg≈8，查照分組數(shù)與劑量比值表得出分組為7組最為合適，劑量梯度設(shè)置為0.8。取雌雄KM小鼠各70只，分別分為7組，按設(shè)計(jì)劑量濃度以靜脈注射給藥一次，注射體積0.2ml/20g小鼠體重。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 小鼠靜脈途徑給藥急性毒性試驗(yàn)

（1）用 Bliss 法計(jì)算雄性小鼠半數(shù)致死量得出：

（2）用 Bliss 法計(jì)算雌性小鼠半數(shù)致死量得出：

（3）用 Bliss 法計(jì)算雌雄合計(jì)半數(shù)致死量得出：

3 討論

在進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)時(shí)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給藥途徑的選擇，要根據(jù)藥品的基本毒性和靶器官的吸收來確定，至少必須包括臨床擬用和藥物能原型進(jìn)入循環(huán)這兩種途徑，但如果是臨床擬采用靜脈給藥的方法，則進(jìn)行急性毒性實(shí)驗(yàn)時(shí)采用靜脈注射一種途徑即可[7]。

急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)束后檢查實(shí)驗(yàn)組重要臟器（心、肝、脾、肺、腎、胃、腸、卵巢/睪丸等）與空白組對照組織結(jié)構(gòu)正常，肉眼未見組織器官發(fā)生病變。僅有個(gè)別小鼠出現(xiàn)肺膿腫、肝組織小灶壞死等病變現(xiàn)象，考慮為自然病變，亦有小鼠出現(xiàn)肺出血情況，則可能與動(dòng)物處死時(shí)胸部受到外力所致。實(shí)驗(yàn)組與空白組相比，沒發(fā)現(xiàn)因?yàn)閯┝慷a(chǎn)生依賴性的病理學(xué)變化，則可認(rèn)定為藥物急性毒性實(shí)驗(yàn)檢查無毒性發(fā)現(xiàn)[8]。

[1]國家食品藥品監(jiān)督管理局.藥物非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范（局令第2號）[S/OL].（2003-8-6）[2012-1-21].http：//www.sda.gov.cn/WS01/CL0053/24472.html.

[2]李琳，呂琳，陳金香，等.我國GLP規(guī)范與國際互認(rèn)[J].中國藥事，2008，12（7）：531-533.

[3]房城.藥物安全性評價(jià)中專題負(fù)責(zé)人的作用及應(yīng)具備的能力[J].科技創(chuàng)新導(dǎo)報(bào)，2011，（13）：230.

[4]王宏濤.藥物安全性評價(jià)與GLP建設(shè)[J].中南藥學(xué)，2010，8（10）：775-777.

[5]卜瑞，曹日輝，黃正明.中藥新藥臨床前安全性評價(jià)中若干問題的分析[J].中國藥物應(yīng)用與監(jiān)測，2005，（5）：19-24.

[6]張愛華，孫志偉.毒理學(xué)基礎(chǔ)[M].北京：科學(xué)出版社，2008.

[7]《化學(xué)藥物急性毒性試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》課題研究組.化學(xué)藥物急性毒性試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則[S/OL].（2005-6-24）.http：//www.sda.gov.cn/gsz05106/11.pdf.

[8]張銀卿，王寧生，劉啟德，等，五苓散的毒性評價(jià)[J].中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2008，2（12）：16-18.