張 佳，范欣麗，葛玉梅，嚴(yán) 杰，孫愛華

(1.溫州醫(yī)學(xué)院檢驗醫(yī)學(xué)院和生命科學(xué)學(xué)院，浙江 溫州 325035;2.浙江醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，浙江 杭州 310053;3.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系，浙江 杭州 310058)

傷寒沙門菌(Salmonella typhi)感染引起的傷寒以及甲型副傷寒沙門菌(S.paratyphi A)、肖氏沙門菌(S.schottmuelleri)和希氏沙門菌(S.hirschfeldii)感染引起的甲、乙和丙副傷寒是常見消化道傳染?。?］。近年來我國不少地區(qū)甲副傷寒發(fā)病率顯著增高，已替代傷寒成為優(yōu)勢病種［2-3］。近年北美、歐洲和東南亞地區(qū)甲副傷寒病例也顯著增加甚至出現(xiàn)暴發(fā)流行［4-8］。目前用于預(yù)防傷寒和副傷寒的疫苗是用傷寒沙門菌莢膜多糖制備的Vi疫苗，但甲型副傷寒沙門菌無莢膜［1］。近年國內(nèi)臨床分離的甲型副傷寒沙門菌菌株耐藥率為35% ～50%，遠(yuǎn)高于傷寒沙門菌［9-11］。因此，甲型副傷寒沙門菌無莢膜以及高耐藥率被認(rèn)為是近年甲型副傷寒高發(fā)的主要原因。

接種疫苗是預(yù)防和控制各種傳染病最為有效和經(jīng)濟(jì)的措施，尤其在控制高耐藥率病原菌感染相關(guān)傳染病方面具有更為重要的意義。甲型副傷寒沙門菌是具有外膜的革蘭陰性菌，外膜蛋白(outer membrane protein，OMP)通常是革蘭陰性菌主要表面抗原成分。在甲型副傷寒沙門菌基因組中，至少有 20個 OMP編碼基因［12］，除 SpaO、OmpA 和 NmpC 外［13-15］，其余OMP免疫原性和免疫保護(hù)作用未有研究報道。本研究中，我們構(gòu)建了甲型副傷寒沙門菌外膜侵襲蛋白PagC編碼基因原核表達(dá)系統(tǒng)，鑒定了重組表達(dá)產(chǎn)物rPagC的免疫原性，檢測了我國甲型副傷寒桿菌臨床菌株pagC基因攜帶率，采用小鼠感染模型初步了解了rPagC的免疫保護(hù)作用，以期為rPagC作為甲型副傷寒沙門菌基因工程疫苗的候選抗原提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源和培養(yǎng) 我國甲型副傷寒沙門菌參考標(biāo)準(zhǔn)株50001、35株分離自甲型副傷寒患者的甲型副傷寒沙門菌株由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系提供。采用營養(yǎng)肉湯(Oxoid)培養(yǎng)上述菌株。

1.2 血清標(biāo)本來源 我國甲型副傷寒沙門菌參考標(biāo)準(zhǔn)株50001兔抗血清、68份甲型副傷寒患者血清及6份正常人血清由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系提供。

1.3 PCR及測序 采用 (Generay)提取甲型副傷寒沙門菌參考標(biāo)準(zhǔn)株50001、35株甲型副傷寒沙門菌臨床菌株基因組DNA，紫外分光光度法測定其濃度和純度［16］。根據(jù)報道的pagC基因序列(GenBank No.:CP000026)以及限制性核酸內(nèi)切酶位點分析結(jié)果、原核表達(dá)載體pET42a(Novagen)多克隆位點，自行設(shè)計PCR引物并由上海Introvigen公司合成。引物序列如下:上游5'-GCG CAT ATG(Nde I)aaa aat att att tta tcc-3'，下游5'-GCG CTC GAG(Xho I)GAA ACG GTA TCC AAC TCC GAC-3'。采用高保真PCR試劑盒(TaKaRa)擴(kuò)增全長pagC基因序列片段。PCR 總體積 100 μl，內(nèi)含 2.5 mol/L各dNTP、250 nmol/L上游及下游引物、2.5 U EX-Taq酶、100 ng DNA 模板和1×PCR緩沖液(pH 8.3)。PCR參數(shù):94℃ 5 min;94℃30 s，50℃ 30 s，72℃ 90 s，30 個循環(huán);72℃ 10 min。采用1 μg/ml溴乙錠預(yù)染色的1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，委托上海Introvigen公司測序。

1.4 原核表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建 采用T-A克隆試劑盒(TaKaRa)將甲型副傷寒沙門菌參考標(biāo)準(zhǔn)株50001的pagC基因擴(kuò)增片段克隆至pMD-19T載體中，形成 pMD-19TpagC后電轉(zhuǎn)化入 E.coli DH5α(Invitrogen)并在LB培養(yǎng)液(Oxoid)中擴(kuò)增，質(zhì)粒提取試劑盒(Axygen)提取pMD-19TpagC后測序［16］。分別將pMD-19TpagC及原核表達(dá)載體pET42a用Nde I和 Xho I雙酶切，回收的pagC基因片段與線性化pET42a用T4 DNA連接酶(TaKaRa)連接形成 pET42apagC。將pET42apagC轉(zhuǎn)化入表達(dá)宿主菌 E.coli BL21DE3(Novagen)形成 E.coli BL21DE3pET42a-pagC，該工程菌在LB培養(yǎng)液中擴(kuò)增后按上法提取質(zhì)粒，然后再次測序。

1.5 rPagC表達(dá)和鑒定 采用含0.5 mmol/L IPTG(Sigma)的LB培養(yǎng)液，37℃震蕩培養(yǎng)4 h，以誘導(dǎo) E.coli BL21DE3pET42a-pagC表達(dá) rPagC［16］。用10%分離膠的SDS-PAGE聯(lián)合Bio-Rad凝膠圖象分析系統(tǒng)檢查rPagC表達(dá)情況并估計產(chǎn)量，采用Ni-NTA親和層析柱(BioColor)提取rPagC。

1.6 免疫原性檢測 將1 mg rPagC與弗氏完全佐劑混合后皮內(nèi)免疫家兔4次，每次間隔一周，末次免疫后兩周采集心血并分離血清，采用免疫雙擴(kuò)散法和ELISA檢測抗血清的效價。分別以1∶1000 稀釋的兔抗rPagC血清和甲型副傷寒沙門菌50001株全菌抗血清、1∶500稀釋的5份甲型副傷寒患者血清為一抗，1∶3000 稀釋的HRP標(biāo)記羊抗兔IgG(Jackson ImmunoResearch)為二抗，采用 Western Blot檢測rPagC的抗原性和免疫反應(yīng)性。

1.7 ELISA 采用1 μg rPagC包被96孔酶標(biāo)板4℃過夜，次日用 0.01 mol/L PBS(pH 7.4)洗板3次。以1∶1000 稀釋的68份甲型副傷寒患者血清為一抗、1∶5000 稀釋的HRP標(biāo)記羊抗人IgG(Jackson ImmunoResearch)為二抗，采用ELISA檢測各血清標(biāo)本OD450值，若OD450值大于相同稀釋度正常人血清OD450均值+3SD 者判為陽性［16］。

1.8 小鼠保護(hù)試驗 將體重(20±2)g健康BALB/C小鼠分組，每組8只，各組小鼠腹腔注射不同濃度(CFU/ml)的甲型副傷寒沙門菌50001 株新鮮培養(yǎng)物 0.5 ml，觀察 7 d，以獲得100%最低致死量(MLD)。將BALB/C小鼠分為2組，每組15只，分別于頸背部皮下注射100 μg 或 200 μg rPagC 與 0.1 mg 氫氧化鋁(Sigma)混合物進(jìn)行免疫，間隔1周按上法再次免疫。末次免疫后2周，用2倍100%MLD的甲型副傷寒沙門菌50001株注射小鼠腹腔進(jìn)行攻擊，觀察7 d內(nèi)動物死亡情況。實驗中以8只200 μg BSA(Sigma)與 0.1 mg 氫氧化鋁混合物免疫的小鼠作為對照。

1.9 微量肥達(dá)試驗 按上法將100 μg或200 μg rPagC與0.1 mg氫氧化鋁(Sigma)混合物免疫小鼠。末次免疫后2周采集抗凝外周血，3000 r/min 4℃離心10 min后取上清，采用微量肥達(dá)試驗檢測上清標(biāo)本的凝集效價［13］。實驗中200 μg BSA與0.1 mg氫氧化鋁免疫小鼠抗凝血上清為對照。

2 結(jié)果

2.1 PCR及測序結(jié)果 從甲型副傷寒沙門菌參考標(biāo)準(zhǔn)株50001、35株甲型副傷寒沙門菌臨床菌株基因組DNA中均擴(kuò)增出預(yù)期大小的pagC基因片段(圖1)。測序及Blast軟件分析結(jié)果顯示，上述36株甲型副傷寒沙門菌株pagC基因與 GenBank中公布的 pagC基因(No.:CP000026)的核苷酸和氨基酸序列相似性分別為99.1%～100%和98.4%～100%。

圖1 甲型副傷寒沙門菌株pagC基因擴(kuò)增片段Fig.1 Amplification fragments of pagC gene from Salmonella paratyphi A strains

2.2 rPagC表達(dá)和提純效果 在 IPTG誘導(dǎo)下，E.coli BL21DE3pET42a-pagC能高效表達(dá) rPagC，其表達(dá)量約占細(xì)菌總蛋白的35%。Ni-NTA親和層析法提純的rPagC經(jīng)SDS-PAGE后在膠上顯示為單一的蛋白條帶(圖2)。

2.3 rPagC抗原性和免疫反應(yīng)性 rPagC免疫家兔后能產(chǎn)生高效價抗體，其免疫雙擴(kuò)散和ELISA 效價分別為1∶4和1∶8000 。Western blot結(jié)果證實，rPagC及甲型副傷寒沙門菌參考標(biāo)準(zhǔn)株50001兔抗血清、5份甲型副傷寒病人血清均能識別rPagC并產(chǎn)生陽性雜交信號(圖3)。

圖2 rPagC蛋白表達(dá)和提純效果Fig.2 Expression and purification effects of rPagC protein

圖3 rPagC與不同血清標(biāo)本W(wǎng)estern Blot結(jié)果Fig.3 Western BlotresultofrPagC with different serum specimens

2.4 ELISA結(jié)果 6份正常人血清OD450均值+3SD為0.25(cut-off值)。68份甲型副傷寒患者血清標(biāo)本中，97.1%(66/68)的ELISA結(jié)果陽性。

2.5 小鼠保護(hù)試驗結(jié)果 甲型副傷寒沙門菌參考標(biāo)準(zhǔn)株50001對小鼠的100%MLD為5×107CFU。BSA免疫對照組小鼠用2倍MLD甲型副傷寒沙門菌參考標(biāo)準(zhǔn)株50001攻擊后7 d內(nèi)均死亡，100 μg 和 200 μg rPagC 對感染小鼠的免疫保護(hù)率分別為73.3%(11/15)和86.7%(13/15)(表1)。

2.6 微量肥達(dá)試驗結(jié)果 rPagC免疫小鼠血清對傷寒沙門菌O抗原的凝集效價僅為0～1∶10，對傷寒沙門菌和甲型副傷寒沙門菌H抗原凝集效價高達(dá)1∶10～1∶40，但對肖氏沙門菌和希氏沙門菌H抗原凝集效價也較低(0～1∶10)。見表2。

表1 rPagC對小鼠免疫保護(hù)效果Table 1 Immunoprotective effect of rPagC in mice

表2 rPagC免疫小鼠微量血清肥達(dá)試驗效價Table 2 Micro-Widal's test titers of serum specimens from rPagC-immunized mice

3 討論

OMP是革蘭陰性菌主要表面蛋白抗原［1，18］。早有文獻(xiàn)報道，沙門菌 OMP 可有效地誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)［19-20］，也可誘導(dǎo)患者或?qū)嶒灨腥緞游锂a(chǎn)生高效價抗體［20］。我們以往的研究結(jié)果也顯示，甲型副傷寒沙門菌重組外膜蛋白rSpaO和rOmpA有免疫原性和免疫保護(hù)作用［13-15］。因此，我們選擇甲型副傷寒沙門菌重組外膜蛋白rPagC作為基因工程疫苗抗原有一定依據(jù)。

蛋白抗原在不同來源菌株中分布廣泛且序列保守，是確定其能否作為基因工程疫苗候選抗原的基本條件之一。我們的實驗結(jié)果顯示，分離自不同地區(qū)甲型副傷寒患者的35株甲型副傷寒沙門菌均攜帶pagC基因，且其核苷酸和氨基酸序列相似性分別高達(dá)99.1% ～100%和98.4% ～100%，表明pagC基因分布廣泛且序列保守。

抗原的免疫原性分為抗原性和免疫反應(yīng)性，具有良好的抗原性和免疫反應(yīng)性是確定蛋白分子能否作為基因工程疫苗候選抗原的另一基本條件。我們的免疫雙擴(kuò)散和ELISA結(jié)果顯示，rPagC免疫家兔后能產(chǎn)生高效價的特異性抗體;Western Blot結(jié)果顯示，rPagC不僅能與其兔抗血清結(jié)合，也能與甲型副傷寒沙門菌全菌抗血清發(fā)生免疫反應(yīng);ELISA結(jié)果顯示，97.1%(66/68)甲型副傷寒患者血清標(biāo)本中存在rPagC抗體。上述實驗結(jié)果表明，PagC具有良好的抗原性和免疫反應(yīng)性。

動物保護(hù)試驗是確定任何抗原分子能否作為基因工程疫苗候選抗原的關(guān)鍵步驟。我們的小鼠免疫保護(hù)試驗結(jié)果顯示，100 μg和200 μg rPagC對感染小鼠的免疫保護(hù)率分別高達(dá)73.3%和86.7%，明顯高于以往報道的甲型副傷寒沙門菌重組外膜蛋白rOmpA的41.7%和58.3%、重組外膜蛋白rNmpC的41.7%和66.7%［14-15］。在肥達(dá)試驗中，所謂傷寒或副傷寒沙門菌H抗原是未經(jīng)加熱處理的活菌抗原，加熱后表面蛋白抗原被破壞，但脂多糖抗原耐熱，稱之為O抗原，由于傷寒或副傷寒沙門菌脂多糖完全相同，故在肥達(dá)試驗中僅用傷寒沙門菌O抗原［14-15］。我們的微量肥達(dá)試驗結(jié)果顯示，rPagC免疫小鼠血清對傷寒沙門菌O抗原凝集效價僅為0～1∶10，對傷寒沙門菌和甲型副傷寒沙門菌H抗原凝集效價高達(dá)1∶10～1∶40。經(jīng)過檢索我們發(fā)現(xiàn)，傷寒沙門菌基因組中也含有 pagC 基因(GenBank accession No.:NC_003198)，其氨基酸序列與甲型副傷寒沙門菌pagC 基因相似性高達(dá)(183/185)［22］。因此，rPagC免疫小鼠血清對傷寒沙門菌H抗原也有較高的凝集效價。由于95%以上傷寒和副傷寒由傷寒沙門菌或甲型副傷寒沙門菌感染所致［2-10］，若采用rPagC作為甲型副傷寒沙門菌基因工程疫苗抗原，不僅可預(yù)防甲型副傷寒沙門菌感染，同時也對傷寒沙門菌有預(yù)防效果。

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