王成云，徐 嶸，吳透明，彭圳圳，褚乃清

（深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東 深圳 518045）

我國現(xiàn)已成為世界皮革的加工中心和貿(mào)易中心，而歐盟是我國最重要的皮革出口市場，據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國出口的皮革制品中，80%以上出口歐盟［1］。在皮革生產(chǎn)中需要使用大量的加工助劑，其中部分加工助劑對人體健康和環(huán)境安全有害。近年來多次在皮革制品中檢出鄰苯二甲酸酯（PAEs），其具有雌性激素效應(yīng)，甚至能致癌［2－5］。為保護(hù)消費(fèi)者身體健康，維護(hù)環(huán)境安全，世界各國紛紛立法限制使用鄰苯二甲酸酯，且受限制的鄰苯二甲酸酯種類不斷增加［6－8］。歐洲化學(xué)品管理署現(xiàn)已將鄰苯二甲酸二（乙基己基）酯（DEHP）、鄰苯二甲酸丁芐酯（BBP）、鄰苯二甲酸二異丁酯（DIBP）和鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）列為需授權(quán)物質(zhì)，并將鄰苯二甲酸二（2－甲氧基乙基）酯（DMOEP）列入第六批高關(guān)注物質(zhì)清單［9－10］。出口歐盟的商品必須滿足歐盟委員會(huì)關(guān)于化學(xué)品注冊、評(píng)估、授權(quán)和限制（REACH）法規(guī)對高關(guān)注物質(zhì)的有關(guān)規(guī)定，否則將被召回，甚至被趕出歐盟市場［11］。近年來，已發(fā)生多起我國出口歐盟的鞋類產(chǎn)品因檢出鄰苯二甲酸酯而被召回的事件［12］，對我國皮革制品的出口造成不利的影響。加強(qiáng)對皮革制品中鄰苯二甲酸酯的監(jiān)管，是保障我國皮革制品順利出口歐盟的重要手段。但目前只有對鄰苯二甲酸二異癸酯（DIDP）、DEHP、鄰苯二甲酸二異壬酯（DINP）、DBP、鄰苯二甲酸二正辛酯（DNOP）和BBP的檢測標(biāo)準(zhǔn)［13］，雖有文獻(xiàn)報(bào)道了皮革制品中DIBP的測定方法［14］，但并未全部覆蓋所有已被列入高關(guān)注物質(zhì)的鄰苯二甲酸酯。因此，有必要建立能同時(shí)測定包含所有列入高關(guān)注物質(zhì)清單的鄰苯二甲酸酯在內(nèi)的多種鄰苯二甲酸酯的測定方法。微波輔助萃取技術(shù)具有簡便快速、檢測通量大、使用化學(xué)試劑少等優(yōu)點(diǎn)［15－18］，而串聯(lián)質(zhì)譜法的靈敏度高、受基體干擾少［19－21］。本研究采用微波輔助萃取技術(shù)提取皮革制品中的鄰苯二甲酸酯，提取物經(jīng)固相萃取柱凈化后進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析，從而建立一種同時(shí)測定皮革制品中20種鄰苯二甲酸酯的方法，并用于市售皮革制品的檢測。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

MARS 5型微波萃取儀：美國CEM公司產(chǎn)品；Retch SM 2000織物研磨儀：德國 Retch公司產(chǎn)品；Agilent 7890A－7000B三重四極桿氣質(zhì)聯(lián)用儀：美國Agilent公司產(chǎn)品；Heidolph 4003旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國Heidolph公司產(chǎn)品；氮吹儀：北京康林科技有限責(zé)任公司產(chǎn)品；0.45μm濾膜：德國Membrana公司產(chǎn)品；固相萃取柱（中性氧化鋁，500mg／3mL）：美國Agilent公司產(chǎn)品。

鄰苯二甲酸二（2－乙基己基）酯（DEHP）、鄰苯二甲酸二（2－乙氧基乙基）酯（DEOEP）、鄰苯二甲酸二環(huán)己酯（DCHP）、鄰苯二甲酸二異癸酯（DIDP）、鄰 苯 二 甲 酸二 （2－丁氧 基 乙 基）酯（DBOEP）、鄰苯二甲酸二甲酯（DMP）、鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）、鄰苯二甲酸二乙酯（DEP）、鄰苯二甲酸二戊酯（DAP）、鄰苯二甲酸二烯丙酯（DALP）、鄰苯二甲酸二異丁酯（DIBP）、鄰苯二甲酸丁芐酯（BBP）、鄰苯二甲酸二（2－甲氧基乙基）酯（DMOEP）、鄰苯二甲酸二己酯（DHXP）、鄰苯二甲酸二丙酯（DPRP）、鄰苯二甲酸二正辛酯（DNOP）、鄰苯二甲酸二庚酯（DHP）、鄰苯二甲酸二異壬酯（DINP）、鄰苯二甲酸二（4－甲基－2－戊基）酯（DMPP）、鄰苯二甲酸二壬酯（DNP）：均由百靈威公司提供，其純度均大于99.0%；乙腈、甲醇、環(huán)己烷、二氯甲烷、異丙醇、石油醚、三氯甲烷、丙酮、正己烷、叔丁基甲醚、乙醇、乙酸乙酯（分析純）：廣州化學(xué)試劑廠產(chǎn)品；甲醇（色譜純）：TEDIA公司產(chǎn)品。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取各標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解，配制成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液儲(chǔ)備液。分別移取適量的各標(biāo)準(zhǔn)溶液儲(chǔ)備液，配制成合適濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液儲(chǔ)備液，用甲醇逐級(jí)稀釋至所需濃度。

1.3 樣品前處理

樣品用織物研磨儀磨成粉末，稱取1.0g樣品，置于微波萃取管中，加入15mL萃取溶劑進(jìn)行微波萃取，萃取溫度比溶劑的沸點(diǎn)高約20℃。萃取完成后，冷卻至室溫，收集上清液，用15mL萃取溶劑進(jìn)行第二次萃取，過濾，合并濾液；濾液

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，在室溫下用氮?dú)饩徛蹈伞Ｓ?0mL甲醇溶解殘留物，轉(zhuǎn)移至已用5mL甲醇活化的固相萃取柱中進(jìn)行凈化；用10mL甲醇分多次淋洗，收集洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干后，用氮?dú)饩徛蹈?；再?mL甲醇溶解殘?jiān)?，定容?5mL；溶液用0.45μm濾膜過濾，進(jìn)行 GCMS／MS分析。必要時(shí)可適當(dāng)?shù)南♂尅?/p>

1.4 分析條件

1.4.1 氣相色譜條件 Agilent HP－5MS色譜柱（30m×0.25mm×0.25μm）；程序升溫：初始溫度90℃，保持1min，以15℃／min升至210℃，保持2min，以5℃／min升至240℃，保持5min，以5℃／min升至250℃，保持5min，以25℃／min升至300℃，保持4min；傳輸線溫度：280℃；進(jìn)樣口溫度：260℃；進(jìn)樣量：1μL；不分流進(jìn)樣；載氣：氦氣（純度＞99.999%），流速1.2mL／min；溶劑延遲5.0min。

1.4.2 質(zhì)譜條件 電離方式：電子轟擊離子化（EI）；離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；電離能量：70eV；氮?dú)饬髁浚?.5mL／min；氦氣流量：2.25mL／min；多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）方式測定，其條件列于表1。

表1 目標(biāo)物的多反應(yīng)監(jiān)測條件Table 1 MRM conditions of targets

2 結(jié)果與討論

2.1 萃取條件的選擇

影響微波萃取效率的主要因素是萃取時(shí)間、萃取溶劑種類、萃取壓力和萃取溫度。較大的萃取壓力、較高的萃取溫度、較長的萃取時(shí)間均有利于提高萃取效率［15］。

通過改變微波萃取時(shí)間，觀察萃取量的變化。開始時(shí)，萃取量隨萃取時(shí)間的增長而增加，但萃取時(shí)間大于15min時(shí)，萃取量的變化就很小。在本實(shí)驗(yàn)中，為充分保證萃取效果，選擇萃取時(shí)間為30min。

萃取壓力取決于萃取溶劑的體積和萃取溫度。通常情況下，萃取溶劑體積約占萃取管體積的三分之一。萃取溫度較高時(shí)，萃取管內(nèi)壓力也隨之升高，萃取溶劑的沸點(diǎn)也相應(yīng)上升。萃取管材料為聚四氟乙烯，可耐260℃的高溫，耐壓高達(dá)50個(gè)大氣壓。微波萃取溫度通常設(shè)定為比萃取溶劑的沸點(diǎn)高10～20℃。在本實(shí)驗(yàn)中，微波萃取溫度設(shè)定為比沸點(diǎn)高約20℃。對于每種萃取溶劑，其萃取溫度是確定的，因此萃取管內(nèi)壓力也隨之確定。

影響萃取效率最關(guān)鍵的因素是萃取溶劑種類。目標(biāo)分析物在溶劑中的溶解度、溶劑與基體之間的相互作用、溶劑的微波吸收特性等均對萃取效率有影響。本研究選取異丙醇、乙腈、V（三氯甲烷）∶V（甲醇）＝2∶1的溶液、叔丁基甲醚等17種溶劑作為微波萃取溶劑，對一種市售皮革制品中的鄰苯二甲酸酯進(jìn)行微波萃取，考察其萃取效果，結(jié)果列于表2。數(shù)據(jù)表明，對于不同的鄰苯二甲酸酯，其最佳萃取溶劑各不相同，而乙腈對于每種鄰苯二甲酸酯的萃取效果均較好。綜合考慮，選擇乙腈為萃取溶劑。

2.2 凈化條件的確定

皮革基質(zhì)相當(dāng)復(fù)雜，萃取液中含有較多雜質(zhì)，為保護(hù)色譜柱，需對其進(jìn)行凈化處理。通?？捎霉滔噍腿≈M(jìn)行凈化處理，選擇HLB柱、Sep－Pak柱、中性氧化鋁柱、LC－C18柱、硅藻土柱等5種常用固相萃取柱凈化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用中性氧化鋁柱凈化時(shí)，色譜圖中雜質(zhì)峰最少。用混標(biāo)溶液分別過柱，測定各固相萃取柱的回收率，結(jié)果表明，中性氧化鋁柱的回收率遠(yuǎn)高于其他萃取柱。因此，選擇中性氧化鋁固相萃取柱進(jìn)行凈化。過柱后，用3mL甲醇多次淋洗固相柱，分別收集每次的洗脫液，經(jīng)測定，前3次洗脫液中均可檢出鄰苯二甲酸酯，而第4次洗脫液中則未檢出。為盡量收集目標(biāo)化合物，同時(shí)盡可能去除基質(zhì)干擾，本研究用10mL甲醇分多次淋洗固相萃取柱。

表2 不同溶劑的萃取效果（mg／kg）Table 2 The extraction effects of various solvents

2.3 分析條件的確定

改變氣相色譜分離條件，觀察各組分的分離情況，選擇分離效果最佳時(shí)的條件為最終氣相色譜分離條件。在此條件下對混標(biāo)進(jìn)行單級(jí)質(zhì)譜全掃描分析，確定各組分的保留時(shí)間，找出各組分的一級(jí)碎片離子。對每個(gè)組分選擇強(qiáng)度較高的碎片離子作為母離子，在離子轟擊掃描模式下進(jìn)行電離轟擊，碰撞能量分別為40、35、30、25、20、15、10、5V，觀察產(chǎn)生的二級(jí)子離子強(qiáng)度隨碰撞能量的變化，二級(jí)子離子響應(yīng)最大的碰撞能量就是最終優(yōu)化的碰撞能量。選擇豐度最高的一對子離子對進(jìn)行定性定量分析，其中豐度最高的子離子對用于定量分析。在表1列出的條件下，對混標(biāo)進(jìn)行分析，得到的MRM總離子流圖示于圖1。DIDP和DINP均為五指峰，DNP位于DIDP五指峰中間，其余17種鄰苯二甲酸酯的分離完全，譜峰峰形尖銳，對稱性好。

2.4 線性關(guān)系和定量下限

在空白基質(zhì)中添加不同濃度的混標(biāo)溶液，按上述條件進(jìn)行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對于每個(gè)組分，其質(zhì)量濃度C在一定范圍內(nèi)與響應(yīng)值A(chǔ)之間有良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)r均大于0.996，各組分的線性方程、線性范圍及線性相關(guān)系數(shù)列于表3。在S／N＝10的條件下，確定各組分的定量下限。

2.5 方法的精密度和回收率

對一個(gè)市售皮革制品中的鄰苯二甲酸酯進(jìn)行測定，共測定9份平行樣，計(jì)算方法的精密度，結(jié)果列于表4，方法的精密度令人滿意。

采用在空白樣品中添加混標(biāo)溶液的方法測定方法的回收率，選用不含目標(biāo)分析物的皮革制品為空白樣品，分別添加低、中、高3個(gè)濃度水平的混標(biāo)溶液，每個(gè)濃度水平測試9個(gè)平行樣，計(jì)算各組分的平均回收率，結(jié)果表明，方法的平均回收率為87.75%～94.59%。

圖1 混標(biāo)的多反應(yīng)監(jiān)測總離子流圖Fig.1 MRM total ion chromatography of mixed standards

表3 方法的線性關(guān)系和定量下限Table 3 The linear relation and limits of quantification

表4 方法的精密度Table 4 The precision experiment

2.6 實(shí)際樣品測試

采用本工作建立的方法對47個(gè)皮革制品（29個(gè)皮鞋樣品、18個(gè)皮革樣品）進(jìn)行測試，結(jié)果在2個(gè)樣品中檢出多種鄰苯二甲酸酯，其余45個(gè)樣品則未檢出。2個(gè)陽性樣品分別為暗紅色和墨綠色皮革制品，均檢出DINP、DIBP、DEHP和DBP，暗紅色皮革制品的含量分別為670.9、17.9、9.6、2.9mg／kg，墨綠色皮革制品的含量分別為632.4、52.3、5.5、4.7mg／kg。暗紅色皮革制品萃取液的MRM總離子流圖示于圖2。

圖2 一個(gè)實(shí)際樣品的MRM總離子流圖Fig.2 MRM total ion chromatography of a real sample

3 結(jié)論

以乙腈為萃取溶劑，采用微波輔助萃取技術(shù)提取皮革制品中的鄰苯二甲酸酯，提取液經(jīng)固相萃取柱凈化后進(jìn)行氣相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜分析，從而建立一個(gè)同時(shí)測定皮革制品中20種鄰苯二甲酸酯的氣質(zhì)聯(lián)用方法。該方法簡捷快速、靈敏度高、定量下限低，可以檢測對象涵蓋了REACH法規(guī)中被列入高關(guān)注物質(zhì)清單的所有鄰苯二甲酸酯，能滿足皮革制品中鄰苯二甲酸酯檢測的需求。

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