張 偉，衛(wèi)軍營，賈 婷，徐長明，張紀(jì)陽，朱云平，錢小紅，張養(yǎng)軍，謝紅衛(wèi)

（1.國防科學(xué)技術(shù)大學(xué)，機(jī)電工程與自動(dòng)化學(xué)院自動(dòng)控制系，湖南 長沙 410073；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京蛋白質(zhì)組研究中心，蛋白質(zhì)組學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206；3.山東省中醫(yī)藥大學(xué)，第二附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，山東 濟(jì)南 250001）

蛋白質(zhì)組學(xué)旨在系統(tǒng)研究細(xì)胞、組織或生物體全套蛋白質(zhì)的組成和功能，以及在不同生理病理?xiàng)l件下量的變化。一般來說，生物樣本可包含成千甚至上萬個(gè)不同的蛋白質(zhì)，并且這些蛋白質(zhì)的相對(duì)含量可能超過5個(gè)數(shù)量級(jí)，這給蛋白質(zhì)組學(xué)研究帶來了不小的技術(shù)挑戰(zhàn)。目前，質(zhì)譜分析技術(shù)是實(shí)現(xiàn)大規(guī)模、高通量蛋白質(zhì)定性和定量分析的主要方法［1］。在基于質(zhì)譜技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，“鳥槍法”（shotgun approach）是常用的實(shí)驗(yàn)策略［2－3］。盡管已經(jīng)有很多成功的應(yīng)用，但“鳥槍法”的技術(shù)局限不容忽視。面對(duì)復(fù)雜樣本，“鳥槍法”肽段鑒定的重現(xiàn)性較差，對(duì)低豐度肽段的監(jiān)測靈敏性較差，并且其定量水平還達(dá)不到基因芯片技術(shù)在轉(zhuǎn)錄組定量分析的水平［4］。

選擇反應(yīng)監(jiān)測技術(shù)（selected reaction monitoring，SRM）在一定程度上彌補(bǔ)了“鳥槍法”的上述缺陷［4－6］。SRM 是一種目標(biāo)蛋白質(zhì)組學(xué)（target proteomics）研究策略，實(shí)驗(yàn)通常在三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（triple quadrupole system，QQQ）［7－8］上進(jìn)行。首先，預(yù)先設(shè)定目標(biāo)蛋白質(zhì)的特定母離子和子離子對(duì)；然后，根據(jù)選擇的離子對(duì)，分別在QQQ的第一級(jí)（Q1）中選擇肽段母離子，在第二級(jí)（Q2）中碎裂母離子，在第三級(jí)（Q3）中監(jiān)測對(duì)應(yīng)的子離子；最后依據(jù)子離子的峰面積，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)的定量分析。通過在母離子和子離子兩個(gè)水平排除干擾，增加了監(jiān)測的靈敏性、重現(xiàn)性以及準(zhǔn)確性，可以用來進(jìn)一步驗(yàn)證候選的差異蛋白質(zhì)。另一方面，肽段通常需要監(jiān)測到8～10個(gè)子離子才能充分證明其存在［9］，即在常規(guī)的SRM策略中，對(duì)于每個(gè)肽段一般需要監(jiān)測8～10個(gè)“母離子－子離子”對(duì)。在Q2中碎裂肽段母離子是非常耗時(shí)的，那么在實(shí)驗(yàn)時(shí)間一定的情況下，可監(jiān)測的目標(biāo)肽段比較少。為了彌補(bǔ)上述缺陷，2011年，Kiyonami等提出了智能選擇反應(yīng)監(jiān)測（intelligent selected reaction monitoring，iSRM）的 新 型 實(shí) 驗(yàn) 策略［10］。iSRM策略把每個(gè)肽段的所有“母離子－子離子”對(duì)分成兩個(gè)部分：一是主要的（primary）定量子離子（一般設(shè)為2），另一是次要的（secondary）定性子離子。其中在整個(gè)分析時(shí)間內(nèi)，一直對(duì)定量子離子進(jìn)行監(jiān)測，當(dāng)定量子離子的信號(hào)強(qiáng)度同時(shí)達(dá)到設(shè)定的閾值，觸發(fā)監(jiān)測定性子離子，用來對(duì)定量肽段的可靠性進(jìn)行驗(yàn)證。iSRM策略減少了每個(gè)肽段監(jiān)測定性子離子的次數(shù)，從而增加了可監(jiān)測目標(biāo)肽段的數(shù)目。

目前，處理基于SRM策略質(zhì)譜數(shù)據(jù)的軟件很多，如 mProphet［11］、Skyline［12］、ATAQS［13］、TIQAM［14］和 MRMer［15］等，但這些軟件大都是基于常規(guī)的SRM策略編寫的數(shù)據(jù)處理軟件，而針對(duì)iSRM策略的數(shù)據(jù)處理工具卻很少見。實(shí)驗(yàn)人員一般利用Thermo Scientific公司的Pin－Point和Xcalibur軟件人工獲得每個(gè)肽段的定量信息，這非常耗費(fèi)時(shí)間和精力。本工作利用MATLAB編程語言設(shè)計(jì)了針對(duì)iSRM策略的蛋白質(zhì)組質(zhì)譜數(shù)據(jù)的自動(dòng)處理軟件——iSQuant。下面首先詳細(xì)介紹iSQuant的數(shù)據(jù)處理算法流程；然后利用3組iSRM質(zhì)譜數(shù)據(jù)驗(yàn)證iSQuant的可重復(fù)性能和線性性能。

1 方法與材料

1.1 iSRM實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

本實(shí)驗(yàn)用于評(píng)估iSQuant的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來自北京蛋白質(zhì)組研究中心［16］，其中包括了小鼠（mouse）的重復(fù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)、酵母（yeast）的重復(fù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以及牛血清白蛋白（bovine serum albu－min，BSA）的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。兩組重復(fù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)都包含3次技術(shù)重復(fù)實(shí)驗(yàn)；標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)集包含5個(gè)批次的上樣量（分別為1、10、100、500和1 000fmol），其中每個(gè)批次有2次技術(shù)重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.1.1 樣本制備 小鼠樣本的制備來自Song等［17］的樣本制備流程。

對(duì)于酵母的樣本制備，首先將200mg酵母懸浮于1mL含50mmol／L NH4HCO3的裂解液中，在冰浴上超聲裂解（每超聲0.1s，暫停2s，重復(fù)100次）。室溫靜置30min后，將裂解液在40 000r／min下離心60min，再將上清液于40 000r／min下離心60min，用Bradford法測定蛋白濃度為1.46g／L。在蛋白提取物（100 μg，68.4μL）中加入 25μL 溶于 50mmol／L NH4HCO3的8mol／L尿素溶液進(jìn)行蛋白變性后，加入2.78μL 100mmol／L的DTT，在37℃水浴反應(yīng)4h，再加入1.46μL 1mol／L的IAA在室溫暗處反應(yīng)1h。用50mmol／L NH4HCO3溶液稀釋，使脲的最終濃度小于1mol／L之后，加入V（胰酶）∶V（底物）＝1∶50的胰酶在37℃水浴中酶切過夜。酶解液濃縮后重溶于2%乙腈（含0.1%甲酸）溶液。

對(duì)于 BSA 的樣本制備，用50mmol／L NH4HCO3溶液對(duì)BSA溶解后，加入DTT（終濃度10mmol／L）于95℃水浴孵育10min。再加入IAA（終濃度50mmol／L）于室溫暗處反應(yīng)1h。最后加入V（胰酶）∶V（底物）＝1∶50的胰酶在37℃水浴中酶切過夜。

1.1.2 色譜－質(zhì)譜條件 Eksigent 2D 液相系統(tǒng)：Eksigent公司產(chǎn)品；在線脫鹽trap柱（u－Precolumn Cartridge，0.3mm×5mm）：戴安公司產(chǎn)品；自制毛細(xì)管直噴柱（75μm×150mm，填料 GEAgel，SP－300－ODS－AP，5μm，金歐亞公司產(chǎn)品）。線性梯度為95%A相（2%乙腈、0.1%甲酸溶液）－50%B相（80%乙腈、0.1%甲酸溶液），梯度時(shí)間1h，流速300nL／min。

觸發(fā)采集二級(jí)質(zhì)譜（quantitation－enhanced data－dependent MS／MS）和iSRM 采集方法：正離子模式，噴射電壓2.1kV，毛細(xì)管溫度200℃，Q1和Q3分辨率設(shè)置為0.7（FWHM），Q2碰撞氬氣壓力19.03Pa，觸發(fā)閾值設(shè)定為100，碰撞能量（CE）按如下公式計(jì)算：CE＝（0.034×母離子的質(zhì)荷比）＋2.314。iSRM方法循環(huán)時(shí)間（cycle time）設(shè)置為2s，觸發(fā)iSRM 采集時(shí)間設(shè)置為0.1s。

1.2 iSQuant的數(shù)據(jù)處理流程

iSQuant的數(shù)據(jù)處理流程示于圖1。在實(shí)驗(yàn)階段，蛋白質(zhì)樣本酶切成肽段混合物，并且根據(jù)預(yù)測工具（如STEPP、ESP Predictor等）或者SRM 數(shù)據(jù)庫（如SRMAtlas、MRMaid－DB等）給出目標(biāo)蛋白質(zhì)的Transition對(duì)列表；然后，肽段混合物進(jìn)入QQQ質(zhì)譜儀，根據(jù)Transition列表在質(zhì)譜儀中設(shè)定Transition信息，并且設(shè)定iSRM模式可獲取RAW格式的iSRM數(shù)據(jù)文件。在數(shù)據(jù)處理階段，首先將RAW格式的文件轉(zhuǎn)換成＿mrml.xml格式文件；然后，讀取＿mrml.xml文件的信息，通過提取每條肽段的定量子離子的定量信息，估計(jì)該肽段的相對(duì)豐度。在提取定量子離子的定量信息之前，需要區(qū)分目標(biāo)肽段的定性子離子和定量子離子，若目標(biāo)肽段的定性子離子未被觸發(fā)（即沒有定性子離子），那么認(rèn)為該肽段監(jiān)測到的定量子離子不可靠；反之，對(duì)定量子離子的離子流色譜峰（extracted ion chromatogram，XIC）進(jìn)行峰監(jiān)測并提取其定量信息。上述數(shù)據(jù)處理流程都是在MATLAB中實(shí)現(xiàn)的。

圖1 iSQuant的數(shù)據(jù)處理流程Fig.1 Data processing workflow of iSQuant

1.3 數(shù)據(jù)格式轉(zhuǎn)換

為了將RAW格式的iSRM數(shù)據(jù)文件轉(zhuǎn)換成＿mrml.xml格式數(shù)據(jù)文件，首先，應(yīng)該將RAW格式文件轉(zhuǎn)為mzXML格式文件，推薦使用ReAdW.exe數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換工具，下載網(wǎng)址為http：／／tools.proteomecenter.org／wiki／index.php？title＝Software：ReAdW；在cmd中輸入命令行：

其中，dir表示存放RAW和mzXML文件的文件路徑名。然后，使用mProphet軟件［11］中的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換工具mMap2.pl將mzXML和transition列表整合成＿mrml.xml格式數(shù)據(jù)文件；在命令行中輸入：

mMap2.pl－xmls dir＼input.mzXML －mach TSQ －strict－trans dir＼TransitionList.txt

其中，dir表示存放RAW和mzXML文件的文件路徑名，產(chǎn)生的＿mrml.xml文件也將自動(dòng)存放在dir文件路徑中。值得注意的是，＿mrml.xml文件不僅包含了mzXML文件的質(zhì)譜數(shù)據(jù)信息，而且還包含了transition的“蛋白質(zhì)－肽段母離子－子離子”對(duì)應(yīng)關(guān)系。

1.4 肽段的相對(duì)豐度估算

針對(duì)＿mrml.xml格式數(shù)據(jù)文件，BSA肽段AEFVEVTK的定量子離子的定量過程示于圖2。

圖2 BSA肽段AEFVEVTK定量離子的定量過程Fig.2 Quantitative process of BSA peptide AEFVEVTK

肽段的相對(duì)豐度估算的算法步驟可描述如下。

1）對(duì)每條肽段，提取其對(duì)應(yīng)的所有transition信息，包括肽段母離子與子離子的對(duì)應(yīng)關(guān)系、子離子在不同色譜流出時(shí)間處的信號(hào)強(qiáng)度信息。

2）從上述子離子中區(qū)分出定量子離子和定性子離子。若沒有定性子離子被觸發(fā)，則表明監(jiān)測到的定量子離子不可靠。在iSRM策略中，通過設(shè)定延遲時(shí)間和動(dòng)態(tài)排除時(shí)間，當(dāng)兩個(gè)定量子離子的信號(hào)同時(shí)達(dá)到儀器設(shè)定的閾值時(shí)才觸發(fā)監(jiān)測定性子離子的信號(hào)強(qiáng)度。一般情況下，肽段在一次實(shí)驗(yàn)中其定性子離子可被觸發(fā)4～6次左右，而定量子離子在每個(gè)采樣循環(huán)中都需要監(jiān)測。因此可以根據(jù)子離子在色譜流出時(shí)間軸上的數(shù)據(jù)點(diǎn)數(shù)來區(qū)分定量子離子（圖2a和2b）和定性子離子（圖2c～2f）。

3）根據(jù)定性子離子來確定定量子離子大致的色譜保留時(shí)間（retention time，RT）。如步驟2中的描述，儀器需要設(shè)定延遲時(shí)間來觸發(fā)定性子離子，第一次觸發(fā)監(jiān)測定性子離子的時(shí)間等于第一次達(dá)到信號(hào)強(qiáng)度閾值的時(shí)間加上延遲時(shí)間。這樣做的好處是盡量使觸發(fā)時(shí)間發(fā)生在定量子離子XIC的最高峰附近，那么可以根據(jù)定性子離子的觸發(fā)時(shí)間來確定定量子離子大致的色譜保留時(shí)間。具體做法是，選擇定性子離子中信號(hào)強(qiáng)度最強(qiáng)的觸發(fā)時(shí)間作為定量子離子的色譜保留時(shí)間（圖2中細(xì)虛線標(biāo)識(shí)的位置）。

4）對(duì)定量子離子進(jìn)行XIC峰檢測，并估計(jì)其定量值。具體做法如下：首先對(duì)定量子離子的信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行Savitzky－Golay去噪處理；其次求取定量子離子在色譜流出時(shí)間軸上的所有局部最大值和局部最小值；然后以其RT為起點(diǎn)，在色譜流出時(shí)間軸上分別向左和向右查找XIC峰的左右端點(diǎn)，當(dāng)遇到的局部最小值小于最大值的0.05倍，或者遇到的局部最大值大于前一個(gè)局部最大值時(shí)，則找到了端點(diǎn)（圖2a和2b中的粗虛線）；最后利用梯形法求取XIC峰的峰面積，用峰面積值來估計(jì)定量子離子的定量值。

5）根據(jù)定量子離子的定量值推算肽段的相對(duì)豐度。通常情況下，每條肽段都有兩個(gè)定量子離子，可以使用這兩個(gè)定量子離子的定量值的加和來估計(jì)其相對(duì)豐度。

2 結(jié)果與討論

可重復(fù)性能（reproducibility）和線性性能（linearity）通常被用來考察定量方法的定量性能［18－19］。為了考察iSQuant的定量性能，本研究利用小鼠的3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和酵母的3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來評(píng)估iSQuant的可重復(fù)性能，以及利用BSA標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來評(píng)估iSQuant的線性性能。

2.1 重復(fù)性能評(píng)估

對(duì)于小鼠的3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，選擇了小鼠蛋白質(zhì)的122條酶切肽段，其中每條肽段選取2個(gè)定量子離子和4～6個(gè)定性子離子。利用iSQuant提取定量信息，共有106條肽段在3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中都觸發(fā)了定性離子的產(chǎn)生，其定量信息可視為可信的肽段定量估計(jì)值。此外，還利用了Xcalibur看圖軟件，采用人工驗(yàn)證的方法獲得了106條肽段在3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中的定量估計(jì)值。人工驗(yàn)證的定量結(jié)果將作為參考標(biāo)準(zhǔn)，來衡量iSQuant的定量結(jié)果。為了考察可重復(fù)性能，首先求取每個(gè)肽段在3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中定量估計(jì)值的平均值，然后分別計(jì)算肽段在每次實(shí)驗(yàn)的定量估計(jì)值與平均值的線性相關(guān)系數(shù)。線性相關(guān)系數(shù)越接近于1，說明定量方法的可重復(fù)性能越好［20］。iSQuant定量結(jié)果在3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)與平均值之間的線性相關(guān)展示圖示于圖3a～3c；人工驗(yàn)證的定量結(jié)果的線性相關(guān)展示圖示于圖3d～3f。由圖3不難看出，iSQuant的3個(gè)線性相關(guān)系數(shù)都為0.97，而人工驗(yàn)證的相關(guān)系數(shù)則都為0.99。盡管iSQuant的相關(guān)系數(shù)略低于人工驗(yàn)證結(jié)果，但是iSQuant方法仍具有很高的可重復(fù)性能。比較iSQuant方法與人工驗(yàn)證方法的差異，雖然兩種方法的重復(fù)性能都隨豐度的降低而變差，但是iSQuant方法的這種趨勢更加明顯，這也是iSQuant的相關(guān)系數(shù)略低于人工驗(yàn)證方法的主要原因。這也說明，iSQuant的性能還有部分提升的空間，應(yīng)該尋求一種更加靈敏的挑峰準(zhǔn)則，縮小軟件在低豐度肽段上帶來的誤差。

對(duì)于酵母的3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，選擇了128個(gè)蛋白質(zhì)中的202個(gè)目標(biāo)肽段，其中每個(gè)肽段選取2個(gè)定量子離子和6個(gè)定性子離子，共包含1 608個(gè)母離子對(duì)。由于這128個(gè)蛋白質(zhì)包含了許多低豐度的蛋白質(zhì)［16］，因此可能存在多條肽段的定性子離子不被觸發(fā)。利用iSQuant提取定量信息，可得到69個(gè)可信的肽段定量估計(jì)值。為了衡量iSQuant的可重復(fù)性能，在數(shù)據(jù)歸一化和取log10對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后，分別計(jì)算69個(gè)肽段在3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中定量估計(jì)值的變異系數(shù)（coefficient of variation，CV），CV 值分布與定量估計(jì)值均值之間的散點(diǎn)分布圖示于圖4。數(shù)據(jù)歸一化采用了Valot等［21］提到的方法，即首先選擇任意一個(gè)實(shí)驗(yàn)為參考實(shí)驗(yàn)（reference run）；然后對(duì)每個(gè)非參考實(shí)驗(yàn)，計(jì)算這次實(shí)驗(yàn)與參考實(shí)驗(yàn)對(duì)應(yīng)肽段的定量估計(jì)值的比值；最后通過除以上述比值的中值求得歸一化以后的定量值。由圖4可以得到，CV的均值低達(dá)1.27%，且CV值分布限制在一個(gè)狹小的范圍內(nèi)（0～2.5%）。極小的CV值分布不難說明，iSRM策略以及iSQuant工具具有很好的可重復(fù)性能。

2.2 線性性能評(píng)估

BSA的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)選擇了BSA蛋白質(zhì)的18條酶切肽段，其中每條肽段選取2個(gè)定量子離子和4～6個(gè)定性子離子。利用iSQuant提取定量信息，共有16條肽段在所有實(shí)驗(yàn)中都觸發(fā)了定性離子的產(chǎn)生，其定量信息可視為可信的肽段定量信息。由于每個(gè)BSA實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的蛋白質(zhì)上樣量都已知（包含 1、10、100、500和 1 000fmol 5個(gè)批次的上樣量，并且每個(gè)批次有2次技術(shù)重復(fù)實(shí)驗(yàn)），因此將已知的上樣量為參考標(biāo)準(zhǔn)，來衡量iSQuant的定量結(jié)果。

圖3 iSQuant在小鼠數(shù)據(jù)上的可重復(fù)性能評(píng)估Fig.3 Reproducibility estimation of iSQuant on mouse dataset

圖4 iSQuant在酵母數(shù)據(jù)上的可重復(fù)性能評(píng)估Fig.4 Reproducibility estimation of iSQuant on yeast dataset

為了考察線性性能，首先對(duì)每個(gè)上樣量，把每個(gè)肽段在兩次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中豐度的平均值作為肽段在這個(gè)上樣量的豐度估計(jì)值；然后分別計(jì)算每個(gè)肽段的豐度估計(jì)值（log10）與實(shí)際上樣量（log10）之間的相關(guān)系數(shù)。如果相關(guān)系數(shù)越接近于1，就說明定量方法的線性性能越好。BSA的16條肽段在5個(gè)上樣量中豐度估計(jì)值（log10）以及相應(yīng)的相關(guān)系數(shù)列于表1。不難得出，16條肽段的相關(guān)系數(shù)都大于0.92，所有相關(guān)系數(shù)的均值和方差分別為0.98和0.02，這表明iSQuant方法具有很好的線性性能。此外，還考察了iSQuant在蛋白質(zhì)水平的線性性能，采用常規(guī)的蛋白質(zhì)推算方法來計(jì)算BSA在每個(gè)上樣量的豐度估計(jì)值（即通過計(jì)算16條肽段的豐度值之和獲得）。BSA的豐度估計(jì)值與其實(shí)際的上樣量之間的線性關(guān)系示于圖5，其中相關(guān)系數(shù)高達(dá)0.99，同樣表明了iSQuant優(yōu)越的線性性能。

表1 BSA肽段在不同上樣量豐度估計(jì)值及相關(guān)系數(shù)Table 1 Abundance estimation and correlation coefficient of BSA peptide among different loading amount

圖5 BSA的豐度估計(jì)值與上樣量的線性關(guān)系Fig.5 Linear correlation between BSA abundance estimation and loading amount

3 結(jié)論

針對(duì)新型的質(zhì)譜選擇反應(yīng)監(jiān)測（SRM）策略——iSRM策略產(chǎn)生的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，開發(fā)了一種肽段定量信息提取工具——iSQuant。該工具采用MATLAB腳本語言編寫，簡便易讀。分別選用了小鼠的3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)、酵母的3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和BSA的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)iSQuant的可重復(fù)性能和線性性能進(jìn)行了評(píng)估。結(jié)果表明，iSQuant的定量結(jié)果具有優(yōu)越的重復(fù)性能和線性性能，基本達(dá)到了人工驗(yàn)證方法的性能要求。

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