江云，王少華,2，王錚敏,2

(1.三明學(xué)院資源與化工學(xué)院，福建三明365004；2.三明學(xué)院應(yīng)用生物技術(shù)研究所，福建三明365004)

藍(lán)花參內(nèi)生真菌的初步分離鑒定

江云1，王少華1,2，王錚敏1,2

(1.三明學(xué)院資源與化工學(xué)院，福建三明365004；2.三明學(xué)院應(yīng)用生物技術(shù)研究所，福建三明365004)

為探索藍(lán)花參（Wahlenbergia marginata(Thunb.)A.DC.）內(nèi)生真菌的種類，對(duì)藍(lán)花參植物的莖、葉進(jìn)行內(nèi)生真菌的分離純化，獲得10株內(nèi)生真菌，表明藍(lán)花參內(nèi)生真菌的多樣性較為豐富；其中產(chǎn)孢特征明顯的4株經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定分別屬于大果粗孢曲霉屬(Lilliputia Boud.et Pat.)、鏈格孢屬(Alternaria Nees)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces Linder)和雙足囊菌屬(Dipodascus Lagerh.)。

藍(lán)花參；內(nèi)生真菌；分離；多樣性

藍(lán)花參（Wahlenbergia marginata(Thunb.)A.DC.）是桔梗科藍(lán)花參屬植物，別名寒草、金線吊葫蘆等，分布于福建各地且民間應(yīng)用廣泛[1-2]。已有的研究表明，藍(lán)花參有抗菌、殺菌、抗炎、抗癌、免疫力抑制等作用，可補(bǔ)虛健脾、化痰止咳、保護(hù)乙醇造成的胃粘膜受損等功效[3-4]；全草含植物甾醇、三萜成分、內(nèi)酯、香豆素、多糖、酚性成分等[5-6]，其化學(xué)成分復(fù)雜且含量極低、不易提取[7-9]。但對(duì)其內(nèi)生真菌的多樣性、內(nèi)生真菌的發(fā)酵及其產(chǎn)物的鑒定、發(fā)酵產(chǎn)物中是否含有類似生物活性物質(zhì)等研究目前尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本文采用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定法嘗試對(duì)藍(lán)花參內(nèi)生真菌進(jìn)行初步分離鑒定，以期了解其多樣性，為今后尋找利用真菌發(fā)酵生產(chǎn)天然藥物的研究提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料

健康粗壯的藍(lán)花參全草采自福建省三明市三明學(xué)院校園。

1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA），查氏培養(yǎng)基[10]。

1.3 內(nèi)生真菌的分離、純化

根據(jù)楊春燕等分離方法[11-13]稍做修改。

用自來水流水沖洗、去除植株污泥后，用20％洗衣粉浸泡10 min；再用自來水流水沖洗30 min后置于干凈的紗布上；用吸水紙吸干植物體的表面水分。

（1）樣品的表面消毒：取植物的莖和葉分別用無菌水洗凈、切割后進(jìn)行表面消毒，處理方法見表1。

表1 植物樣品的表面消毒

（2）內(nèi)生真菌的分離：將表面消毒后的植物樣品用無菌手術(shù)剪剪切（莖段去掉兩端、再剪切成0.2 cm小段；葉片除去邊緣四周，再剪切成0.5 cm×0.5 cm），放置在PDA培養(yǎng)基平皿上，置22℃溫箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)3～7 d后即可見樣品邊緣有菌絲長(zhǎng)出，挑取菌絲到PDA平板上分離、純化；純化后的菌株轉(zhuǎn)到PDA斜面培養(yǎng)基上4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

為檢查表面消毒和無菌操作是否徹底，設(shè)對(duì)照1：未切割兩端和任何剪切的消毒莖段；對(duì)照2：未做任何剪切的消毒葉片；對(duì)照3：在超凈臺(tái)上放置5個(gè)敞開蓋子的PDA培養(yǎng)基平皿，直到實(shí)驗(yàn)完成；對(duì)照4：將升汞消毒后的最后一次漂洗無菌水涂布于PDA培養(yǎng)基上。將上述對(duì)照同樣置22℃溫箱中培養(yǎng)。結(jié)果均無任何菌絲長(zhǎng)出，證明植物組織塊表面消毒徹底，無菌操作合格，確保篩選到的菌種為內(nèi)生真菌。

1.4 內(nèi)生真菌的鑒定

采用點(diǎn)植培養(yǎng)法[10]，挑取微量菌絲點(diǎn)植在查氏培養(yǎng)基平板的中心位置，然后于28℃溫箱培養(yǎng)10 d，記錄每天菌落的大小、顏色、表面紋飾、質(zhì)地、高度、菌落邊緣形狀等。

內(nèi)生真菌的形態(tài)學(xué)鑒定[14-16]：用查氏培養(yǎng)基培養(yǎng)分離純化過的菌種數(shù)日后，挑取菌絲或孢子用溴酚藍(lán)染色制成玻片，在顯微鏡下觀察孢子形態(tài)、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、菌絲顏色及有無橫隔等特征。

2 結(jié)果

2.1 藍(lán)花參內(nèi)生真菌的分離

對(duì)樣品表面長(zhǎng)出的菌絲進(jìn)行分離純化，結(jié)果見表2。

2.2 藍(lán)花參內(nèi)生真菌的鑒定

對(duì)純化菌株菌絲及分生孢子的形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行觀察，鑒定出4種具有明顯的孢子形態(tài)的內(nèi)生真菌分別屬于大果粗孢曲霉屬（Lilliputia Boud. et Pat.）、鏈格孢屬（Alternaria Nees）、裂殖酵母屬（Schizosaccharomyces Linder）和雙足囊菌屬（Dipodascus Lagerh.），結(jié)果見表3和圖1～4。

表2 內(nèi)生真菌的分離結(jié)果

表3 內(nèi)生真菌的鑒定結(jié)果

續(xù)表3

圖1 Lilliputia Boud.et Pat.（LJ1）（×40）

圖2 Alternaria Nees（LJ3）（×40）

圖3 Schizosaccharomyces Linder（LJ7）（×40）

圖4 Dipodasous Lagerh.（LY1）（×40）

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)采用馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基，以75％酒精和0.1％升汞作表面消毒劑，從藍(lán)花參植物分離到10株內(nèi)生真菌，顯示藍(lán)花參內(nèi)生真菌的多樣性較為豐富。對(duì)其中產(chǎn)孢子且孢子特征明顯的4種進(jìn)行鑒定、分別為半知菌亞門的4個(gè)屬：大足粗孢曲霉屬(Lilliputia Boud,et,Pat)、鏈格孢屬(Alternaria Nees)、裂殖酵母屬(Schinosaccharomyces Linder)、雙足囊菌屬(Dipodasous Lagerh)。

在純化的10個(gè)菌株中，只對(duì)產(chǎn)孢子且孢子特征明顯的4種進(jìn)行鑒定，還有不產(chǎn)孢子或孢子特征不明顯的6種還需通過促孢子培養(yǎng)等實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步完成，說明用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定內(nèi)生真菌存在一定局限。后續(xù)研究中可以通過分子生物學(xué)手段進(jìn)行ITS序列的測(cè)定，更加快速、準(zhǔn)確地了解藍(lán)花參內(nèi)生真菌的種類。實(shí)驗(yàn)植株的選取可能對(duì)內(nèi)生菌株的產(chǎn)生多寡有一定關(guān)系。選用健康粗壯的植株能夠獲取更多的內(nèi)生菌株，但是否有關(guān)聯(lián)有待進(jìn)一步研究。

［1］中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所.云南植物志（5）［M］.北京：科學(xué)出版社，1991.

［2］福建省醫(yī)藥研究所.福建藥物志［M］.福州：福建人民出版社，1979.

［3］孫嬌，張超，張慶芝.滇產(chǎn)藍(lán)花參的生態(tài)學(xué)研究［J］.中國(guó)民族民間醫(yī)藥，2010，17：60-62.

［4］張文清，念其濱，陳婷婷，等.藍(lán)花參止咳化痰的藥效及急性毒性實(shí)驗(yàn)［J］.福建中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，22（5）：42-43.

［5］中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物資源開發(fā)研究所.中藥志（4）［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1998：693.

［6］柯鵬頡.藍(lán)花參中揮發(fā)油的氣質(zhì)聯(lián)用分析［J］.海峽藥學(xué)，2006，18（4）：88-89.

［7］孫嬌，張慶芝.民族藥藍(lán)花參提取工藝研究［J］.中藥材，2010，33（9）：1494-1497.

［8］李曉丹.石珊瑚活性成分Montiporyne F的全合成［D］.哈爾濱：黑龍江大學(xué)，2009.

［9］孫嬌，莊緒會(huì)，張慶芝.紫外-可見分光光度法測(cè)定藍(lán)花參中多炔類化合物的含量［J］.云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，33（6）：51-54.

［10］周德慶.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程［M］.北京：高等教育出版社，2006.

［11］楊春燕.云南八角蓮內(nèi)生真菌的分離、鑒定的初步探索［J］.生物學(xué)雜志，2006，23（6）：32-34.

［12］王錚敏，王少華，王娜，等.三明市八角蓮內(nèi)生真菌的初步分離［J］.三明學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，29（6）：78-80.

［13］石瑋，羅建平，丁振華，等.千層塔內(nèi)生真菌分離鑒定的初步研究［J］.中草藥，2005，36（2）：281-283.

［14］魏景超.真菌鑒定手冊(cè)［M］.上海：上?？萍汲霭嫔纾?979.

［15］中國(guó)科學(xué)院微生物研究所.常見與常用真菌［M］.北京：科學(xué)出版社，1978.

［16］邵力平，沈瑞祥，張素軒，等.真菌分類學(xué)［M］.北京：中國(guó)林業(yè)出版社，1988.

Separation of the Endophytic Fungus on Wahlenbergia marginata(Thunb.)A.DC. of Fujian Sanming

JIANG Yun1,WANG Shao-hua1,2,WANG Zheng-min1,2
(1.School of Resources and Chemical Engineering,Sanming University,Sanming 365004,China; 2.Institute of Applied Biotechnology,Sanming College,Sanming 365004,China)

10 strains of endophytic funguses were separated from the stems and the leaves of Wahlenbergia marginata (Thunb.)A.DC.in order to explore its species.The results showed that the endophytic funguses of Wahlenbergia marginata own a great variety of diversity,which 4 strains were classified into Lilliputia Boud.et Pat.,Alternaria Nees,Schizosaccharomyces Linder and Dipodascus Lagerh.based on morphological characters.

Wahlenbergia marginata；endophytic fungi；separate,diversity

Q93.331

A

1673-4343（2013）06-0067-04

2013-09-28

福建省教育廳科技項(xiàng)目（JA10264）;三明市科技局科技項(xiàng)目（2009-s-1）;福建省高校服務(wù)海西重點(diǎn)項(xiàng)目（HX200801）

江云，男，福建福州人，大學(xué)生。通訊作者：王錚敏，女，福建福州人，副教授。研究方向：植物學(xué)。