徐 峰，張國梁，鄒 江

(1天津醫(yī)科大學(xué)第一中心臨床學(xué)院，天津300192;2天津市第一中心醫(yī)院)

大量實驗證明，結(jié)直腸癌(CRC)發(fā)生是一個多基因參與的復(fù)雜過程，基因DNA甲基化［1］可能是CRC腫瘤細胞中抑癌基因失活的機制之一［2］。催化DNA甲基化的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases，DNMTs)主要包括 DNMT1、DNMT3A、DNMT3B和 DNMT3L。DNMT3A和 DNMT3B具有重新甲基化活性［3］，據(jù)報道DNMT3A和DNMT3B基因調(diào)控區(qū)的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)位點與基因的表達調(diào)控密切相關(guān)。盡管已鑒定出大量的SNPs位點，但多局限于單個位點，故對于與CRC有關(guān)的SNPs研究尚不夠完善。本研究根據(jù)以前研究報道，采用病例—對照的分子流行病學(xué)方法，應(yīng)用Sequenom MassArray質(zhì)譜分析技術(shù)對DNMT3A和DNMT3B的10個SNPs位點與CRC易感性進行了研究?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 觀察組為天津市第一中心醫(yī)院2011年1月～2012年6月確診的89例CRC患者，男46例，女43例;年齡(56.37±15.46)歲，均經(jīng)臨床及病理檢查確診，且臨床資料完整，采集其血液樣本，標(biāo)本采集前均未有放化療或抗腫瘤藥物使用記錄。對照組為94例健康者，男49例，女45例;年齡(54.63±13.32)歲。兩組性別、年齡等資料均匹配。兩組人群均系天津市漢族人群，個體之間均無血緣關(guān)系。調(diào)查和取樣均征得受試者本人知情同意，采集外周靜脈血3～4 mL，置于5 mL的 EDTANa2抗凝管中，-80℃凍存。

1.2 研究方法

1.2.1 候選基因及SNP的選擇 根據(jù)所查閱的相關(guān)科研文獻報道，并依據(jù)SNP數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp，dbSNP)中 DNMT3A 和 DNMT3B基因的SNP位點的連鎖不平衡狀態(tài)，選取位于啟動子區(qū)域和下游調(diào)控區(qū)的10個SNPs位點，分別為:DNMT3A rs1550117、rs13420827、rs11887120、rs13428812 和 DNMT3B rs6119954、rs4911259、rs4911107、rs1569686、rs2424908、rs2424932。

1.2.2 DNA提取 用QIAGEN基因組DNA提取試劑盒提取外周血白細胞基因組DNA，提取步驟參照說明書，采用紫外分光光度計行DNA水平測定，并標(biāo)化至質(zhì)量濃度 ＞25 ng/μL，純度 260/280≥1.7，260/230≥1，樣本量 ＞20 μL，提取好的 DNA 保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 引物的設(shè)計與合成 針對10個單核苷酸多態(tài)性位點，用Sequenom MassArray Designer 3.0軟件設(shè)計PCR擴增及延伸引物，其中特異性擴增引物序列見表1。

表1 擴增及延伸引物序列

1.2.4 基因SNP分型 利用Sequenom MassArray質(zhì)譜陣列技術(shù)(美國，Sequenom公司)對10個SNP位點進行基因分型。方法為:① 多重PCR反應(yīng)擴增DNA樣本;②蝦堿性磷酸酶(shrimp alkaline phosphatase，SAP)反應(yīng)，去除未反應(yīng)完的 dNTP;③單堿基延伸反應(yīng)(single base extension，SBE)，于SNP位點處延伸上帶有熒光信號標(biāo)記的單個堿基;④將所得反應(yīng)產(chǎn)物用樹脂脫鹽后經(jīng)自動點樣儀點樣于384孔板PCR儀(384-element SpectroCHIP array)上;⑤將點制后的芯片用基質(zhì)輔助的激光解吸質(zhì)譜儀(MAIDI-TOF MS)檢測等位基因，根據(jù)單堿基延伸的等位基因的相對分子質(zhì)量差異進行基因分型;⑥應(yīng)用MassArray Typer軟件分析質(zhì)譜圖。

1.2.5 SNPs連鎖不平衡分析 采用Haploview4.2軟件對樣本中的SNPs進行連鎖不平衡(link disequilibrium，LD)分析。

1.2.6 SNPs單體型分析 通過Haploview4.2軟件對DNMT3A和DNMT3B SNPs行單體型分析。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用Plink1.06軟件進行數(shù)據(jù)分析和質(zhì)控，兩組等位基因和基因型頻率行Hardy-Weinberg平衡檢驗，計算優(yōu)勢比(OR)及其95%CI［4］，采用 Logistic 回歸進行矯正。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組基因SNP分型結(jié)果 兩組10個SNPs位點 DNMT3A rs1550117、rs13420827、rs11887120、rs13428812 和 DNMT3B rs6119954、rs4911259、rs4911107、rs1569686、rs2424908、rs2424932 的等位基因分別為 A/G、G/C、C/T、A/G、A/G、T/G、A/G、T/G、C/T、A/G。兩組最小等位基因頻率(MAF)均＞1%，且符合Hardy-Weinberg平衡。統(tǒng)計分析結(jié)果表明，rs6119954和rs2424908在觀察組與對照組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(rs6119954:OR=0.640，95%CI:0.411～0.996，P=0.047;rs2424908:OR=0.612，95%CI:0.405～0.926，P=0.020)。

2.2 SNPs連鎖不平衡分析結(jié)果 DNMT3A的4個位點之間不存在緊密連鎖(r2＜0.8)，DNMT3B基因構(gòu)建LD顯示有1個單倍型塊(haplotype Block)，由rs6119954、 rs4911259、 rs4911107、 rs1569686、rs2424908、rs2424932組成，兩兩之間存在強連鎖(rs6119954和rs4911259之間的連鎖性稍差，r2=0.83)，見圖1。

圖1 DNMT3A和DNMT3B SNPs LD分析

2.3 SNPs單體型分析結(jié)果 DNMT3A的4個位點不存在緊密連鎖，故未檢測到單體型;DNMT3B的6個SNP位點間存在緊密連鎖，本實驗檢出4個單體型，分別為 TGTAGG、CATAGG、CGGGTA 和 CGTAGG，其中觀察組與對照組TGTAGG單體型頻率分別為86.5%、34.0%;CATAGG單體型頻率分別為40.4%、27.6%，兩組比較，P均＜0.05;CGGGTA單體型頻率分別為20.2%、18.6%，CGTAGG單體型頻率分別為2.2%、1.1%，兩組比較，P均 ＞0.05。

3 討論

據(jù)報道，CRC的發(fā)生、發(fā)展過程中既有原癌基因的激活，又有抑癌基因的失活及突變，包括遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)的改變。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)改變的主要形式，具體過程是指由DNMTs催化，以S-腺苷蛋氨酸(S-adenosyl methionine，SAM)作為甲基供體，將甲基轉(zhuǎn)移到胞嘧啶上，生成5'-甲基胞嘧啶(5-mC)的過程［5］，這是脊椎動物DNA惟一一種自然的共價修飾方式。DNMT3在腫瘤在發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，負(fù)責(zé)基因的重新甲基化。DNMT3A定位于人染色體2p33，DNMT3B定位于人染色體20q11.2?；蛘{(diào)節(jié)區(qū)CpG島的高甲基化被看作腫瘤抑制基因失活及其他遺傳病發(fā)生的物質(zhì)基礎(chǔ)，而DNMT3在CpG島的重新甲基化過程中發(fā)揮重要作用。實驗表明，DNMT3A和DNMT3B基因通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)甲基化過程而參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，已發(fā)現(xiàn)其在許多腫瘤細胞中高表達［6］。最近研究顯示，DNMT3A和DNMT3B基因的單核苷酸多態(tài)性在頭頸部鱗癌、肺腺癌和肺小細胞癌、大腸腺癌、食管癌、胃癌、腎癌及白血病等多種腫瘤的發(fā)病中具有重要性［7］。

SNPs是基因組水平上由單個核苷酸變異引起的一種DNA序列多態(tài)性。由于其數(shù)目眾多、分布廣泛且相對穩(wěn)定，已被作為第三代基因遺傳標(biāo)志［8］。作為一種穩(wěn)定的遺傳基因早期突變，SNP與疾病有穩(wěn)定的相關(guān)性。因此，通過高密度SNP圖譜，用相關(guān)性分析的方法搜尋某些復(fù)雜遺傳疾病的致病基因，有助于在基因水平了解疾病發(fā)生的機制。隨著國際人類基因組單體型計劃(Hapmap)人類遺傳性圖譜的構(gòu)建，SNPs已成為人類基因組研究的重要組成部分。本研究采用的Sequenom MassArray SNP檢測系統(tǒng)，其基本原理為基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)技術(shù)。其通過采用高密度SpectroCHIP點陣芯片，按照A、T、G和C的信號強弱及質(zhì)量差異得出模板序列信息，可高效自動化的篩查SNPs，該系統(tǒng)作為一種高通量的檢測系統(tǒng)，適合SNPs的大規(guī)模篩查使用。

Gowher等［9］研究認(rèn)為，DNMT3A 基因突變和啟動子甲基化會導(dǎo)致基因的mRNA表達下降亦是基因變異導(dǎo)致癌癥危險性增加的機理。Wu等［10］認(rèn)為，DNMT3A基因R822H基因G→A突變后使DNMT3A與ATP的結(jié)合出現(xiàn)位阻，酶的活性(DNA修復(fù)能力)明顯下降，故DNMT3A基因R822H位點突變是導(dǎo)致結(jié)腸癌危險性的原因。Fan等［11］研究后發(fā)現(xiàn)DNMT3A基因啟動子區(qū)域rs1550117與胃癌的易感性緊密相關(guān)，可作為預(yù)測年齡＜60歲的個體對胃癌易感性的一個分類標(biāo)志。另有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)DNMT3A rs13420827位點與卵巢癌的發(fā)生有關(guān)。本研究未能發(fā)現(xiàn)DNMT3A基因rs1550117和rs13420827與CRC相關(guān)，提示以上兩個位點突變可能存在組織器官的差異性。

本研究發(fā)現(xiàn)散發(fā)CRC患者DNMT3B基因rs1569686位點TT基因型頻率明顯高于普通人群，但值得注意的是，癌癥患者和普通人群的突變率均高于 Hong等［12］的報道，提示 DNMT3B 基因rs1569686位點存在明顯的種族差異。在以往的研究工作中，DNMT3A和DNMT3B SNP作為風(fēng)險因素來衡量人群腫瘤的易感性，多局限于單個位點，而在本研究中，通過前期應(yīng)用全基因組關(guān)聯(lián)研究中國漢族人群的CRC發(fā)病情況，結(jié)合查閱的相關(guān)科研文獻，對發(fā)現(xiàn)的10個位點進行研究，結(jié)果提示DNMT3B的2個SNP位點rs6119954和rs2424908多態(tài)性與漢族人群CRC發(fā)病相關(guān)，這在中國漢族人群是首次報道，在其他人種亦未見報道。Hu等［13］研究證明rs1569686的TT等位基因型比其他基因型胃癌的發(fā)生率低。鮑倩等［14］通過對DNMT3B基因啟動子區(qū)rs1569686的檢測，證實rs1569686位點G等位基因在CRC發(fā)生過程中是一個潛在保護因素。

連鎖不平衡研究是尋找疾病相關(guān)基因易感位點的手段之一，單體型分析是其不可缺少的工作，利用配對連鎖不平衡構(gòu)建單體型塊在全基因組范圍內(nèi)作圖是目前人類基因組研究的重要內(nèi)容之一［15］。我們采用基于最大期望算法(Expectation-Maximization，EM)的Haploview4.2軟件，根據(jù)等位基因頻率決定散發(fā)群體中雜合子個體的單倍型分布，得出的群體單體型頻率較接近真實情況。在本實驗中，配對連鎖不平衡檢驗表明，DNMT3A的4個位點連鎖不平衡程度較低，而DNMT3B的6個位點間存在強連鎖，除rs6119954和rs4911259之間連鎖性稍差(r2=0.83)外的其他位點之間接近或達到了完全的連鎖不平衡。因此，在實際應(yīng)用中，達到完全連鎖不平衡的位點之中選擇其一即可代表其他位點的等位基因型。而且，此6個位點歸屬于一個單體型塊，能否在他們中篩選出單體型標(biāo)簽SNP(haplotype tag SNP，htSNP)，并探討與疾病的關(guān)系是我們今后的研究重點。

將來的研究可能是進一步驗證DNMT3A和DNMT3B基因位點與CRC的關(guān)系，如使用基因敲入技術(shù)使小鼠表達DNMT3A和DNMT3B基因位點突變蛋白，然后觀察小鼠CRC的發(fā)生率。而結(jié)腸癌作為多基因異常疾病，分析其他甲基轉(zhuǎn)移酶遺傳異常的連鎖不平衡關(guān)系亦非常重要。因此，CRC發(fā)病的危險因素還有待于進一步研究，以利于更全面的闡述人群CRC的發(fā)病機制。

［1］Eng C，Herman JG，Baylin SB，et al.A bird's eye view of global methylation［J］.Nat Getet，2000，24(2):101-102.

［2］Esteller M.Epigenetics provides a new generation of oncogenes and tumour-suppressor genes［J］.Br J Cancer，2006，94(2):179-183.

［3］Liu K，Wang YF，Cantemir C，et al.Endogenous assays of DNA methyltransferases:evidence for differential activities of DNMT1，DNMT2，and DNMT3 in mammalian cells in vivo［J］.Mol Cell Biol，2003，23(8):2709-2719.

［4］Purcell S，Neale B，Todd-Brown K，et al.PLINK:a tool set for whole-genome association and population-based linkage analyses［J］.Am J Hum Genet，2007，81(3):559-575.

［5］張永彪，褚嘉祐.表觀遺傳學(xué)與人類疾病的研究進展［J］.遺傳，2005，27(3):466-472.

［6］Schmidt WM，Sedivy R，F(xiàn)orstner B，et al.Progressive up-regulation of genes encoding DNA methyltransferase in the colorectal adenoma-carcinoma sequence［J］.Mol Carcing，2007，46(9):766-772.

［7］Chang KP，Hao SP，Liu CT，et al.Promoter polymorphisms of DNMT3B and the risk of head and neck squamous cell carcinoma in Taiwan:a case-control study［J］.Oral Oncol，2007，43(4):345-351.

［8］Divne AM，Allen M.A DNA micro-array system for forensic SNP analysis［J］.Forensic Sci Int，2005，154(2-3):111-121.

［9］Gowher H，Loutchanwoot P，Vorobjeva O，et al.Mutational analysis of the catalytic domai-n of the murine Dnmt3a DNA-(cytosine C5)-methyltransferase［J］.J Mol Biol，2006，357(3):928-941.

［10］Wu H，Coskun V，Tao J，et al.DNMT3a-dependent nonpromoter DNA methylation facilitates transcription of neurogenic genes［J］.Science，2010，329(5990):444-448.

［11］Fan H，Liu D，Qiu X，et al.A functional polymorphism in the DNA methyltransferase-3A promoter modifies the susceptibility in gastric cancer but not in esophageal carcinoma［J］.BMC Med，2010，(8):12.

［12］Hong YS，Lee HJ，You CH，et al.DNMT3B 39179GT polymorphism and the risk of ad-enocarcinoma of the colon in Koreans［J］.Biochem Genet，2007，45(3-4):155-163.

［13］Hu J，F(xiàn)an H，Liu D，et al.DNMT3B promoter polymorphism and risk of gastric cancer［J］.Dig Dis Sci，2010，55(4):1011-1016.

［14］鮑倩，何幫順，陳麗萍，等.DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3B基因啟動子單核苷酸多態(tài)性與結(jié)直腸癌的相關(guān)性［J］.中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2012，46(1):53-57.

［15］Lai E，Bowman C，Bansal A，et al.Medical application of haplotype-based SNP maps:learning to walk before we run［J］.Nat Genet，2002，32(3):353.