郭影坤， 隋 陽

（東北制藥集團(tuán)供銷有限公司， 遼寧 沈陽 110023）

纈沙坦是一種非肽類的血管緊張素 II 受體AT1拮抗劑，選擇性作用于AT1受體亞型，從而阻斷血管緊張素II介導(dǎo)的生理效應(yīng)。纈沙坦對(duì)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）沒有抑制作用，不引起緩激肽和 P物質(zhì)的儲(chǔ)留，因而不引起咳嗽等不良反應(yīng)[1]。纈沙坦能擴(kuò)張血管，改善心室及血管的重塑，抑制醛固酮，保鉀排鈉，從而達(dá)到降壓作用。纈沙坦用于治療各類輕至中度高血壓，尤其適用腎臟損害所致繼發(fā)性高血壓。此外，纈沙坦還可顯著減少尿蛋白排出量，對(duì)慢性腎小球腎炎病人有益[2]。有關(guān)纈沙坦?jié)舛葴y定的高效液相色譜法國內(nèi)外都有報(bào)道[3-10]，本實(shí)驗(yàn)建立了一種高效液相色譜法測定纈沙坦血漿濃度, 在國內(nèi)外文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上改進(jìn)了血樣預(yù)處理方法, 重新選擇了內(nèi)標(biāo)物, 優(yōu)化了流動(dòng)相的組成, 采用液-液萃取法進(jìn)行血漿預(yù)處理，具有方法簡便, 回收率高, 重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn),能夠靈敏、快速檢測人血漿中纈沙坦的濃度，可用于纈沙坦的體內(nèi)分析及臨床藥學(xué)研究，為人體藥代動(dòng)力學(xué)研究提供了測定方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀 器

SHIMADZU LC10-AT系列高效液相色譜儀、HY-4調(diào)速多用振蕩器、XW-80A旋渦混合器、電熱恒溫水浴鍋、WM-2A型無油氣體壓縮機(jī)、LD4-2A低速離心機(jī)。

1.2 藥品與試劑

代文（纈沙坦膠囊），規(guī)格：80 mg/粒，北京諾華制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：X0372，有效期2年，遮光，密閉保存。纈沙坦對(duì)照品：中國藥品生物制品檢定所，批號(hào) 100651-200401，含量 98.8%。磷酸二氫鉀、磷酸、二氯甲烷為分析純，乙腈和甲醇為色譜純，水為二重蒸餾水。空白血漿由中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院輸血科提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 血漿樣品的分析方法

2.1.1 血漿樣品的預(yù)處理

取 0.2 mL血漿于具塞玻璃試管中，加入內(nèi)標(biāo)0.5 μg·mL-1替米沙坦 50 μL，補(bǔ)加 50 μL 甲醇，加 1 mol·L-1HC l100 μL, 再加入 3 mL 二氯甲烷，震蕩提取15 min，3 500 r/minpm離心10 min, 取下層有機(jī)相，與50 ℃水浴中氮?dú)獯蹈?，于殘?jiān)屑尤?00 μL流動(dòng)相，渦旋混合30 s，進(jìn)樣10 μL

2.1.2 色譜條件

Agilent ZORBAZX Eclipse XDB-C18 柱（4.6×150 mm, 5 μm）；流動(dòng)相：乙腈：0.01 mol·L-1KH2PO4(pH=2.96)=48︰52(V/V)；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：激發(fā)波長265 nm，發(fā)射波長378 nm；柱溫：30 ℃。

2.2 分析方法確證

2.2.1 方法的專屬性

分別取6名受試者混合空白血漿0.2 mL，按“血漿樣品的分析方法”項(xiàng)下操作，進(jìn)樣 10 μL，得色譜圖1-A；將一定濃度的纈沙坦加入空白血漿中，依同法操作，得色譜圖1-B；取健康受試者給藥后收集的血漿樣品，依同法操作，得色譜圖1-C。結(jié)果表明，血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾纈沙坦和內(nèi)標(biāo)替米沙坦的測定。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

取空白血漿0.2 mL，依次加入濃度為50，100，200，500，1 000，2 000，5 000，10 000，20 000 ng·mL-1的纈沙坦標(biāo)準(zhǔn)系列的甲醇溶液，配制相當(dāng)于 12.5，50，125，250，500，1 250，2 500，5 000 ng·mL-1的血漿樣品，按“血漿樣品的分析方法”項(xiàng)下的方法操作，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。以血漿中待測物的濃度為橫坐標(biāo)，以待測物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比為縱坐標(biāo)，用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行回歸計(jì)算，求得直線回歸方程，即為標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程見表 1。本方法的最低定量限為 12.5 ng·mL-1，線性范圍為12.5~5000 ng·mL-1。

表1 方法確證標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 1 Confirming standard curve

2.2.3 準(zhǔn)確度與精密度

取空白血漿0.2 mL，按“標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備”項(xiàng)下操作，制備纈沙坦低、中、高3個(gè)濃度（分別為25，250，2 500 ng·mL-1）的質(zhì)量控制樣品（QC），6個(gè)樣本，重復(fù)3個(gè)分析批，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線同批測定，以當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算QC樣品的測得濃度，與配制的濃度對(duì)照，求得本法的準(zhǔn)確度與精密度，數(shù)據(jù)見表2。

表2 HPLC法測定血漿中纈沙坦的準(zhǔn)確度與精密度Table 2 Accuracy and precision of determining valsartan in human plasma by HPLC method

圖1 HPLC法測定血漿中纈沙坦色譜圖Fig.1 Determination of valsartan in human plasma by HPLC

A 空白血漿樣品圖 B 空白血漿樣品加纈沙坦、替米沙坦標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖（替米沙坦 500 ng·mL-1，峰 1； 纈沙坦 2 000 ng·mL-1，峰 2）C 受試者口服纈沙坦膠囊后1.0 h的血漿樣品色譜圖

2.2.4 提取回收率

取空白血漿0.2 mL，按“標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備”項(xiàng)下操作，制備纈沙坦低、中、高3個(gè)濃度（分別為25，250，2500 ng·mL-1）的樣本，每個(gè)濃度進(jìn)行 6樣本分析。同時(shí)另取相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析，獲得相應(yīng)峰面積的平均值，以每一濃度兩種處理方法的峰面積，計(jì)算提取回收率。結(jié)果表明，低、中、高三個(gè)濃度的平均提取回收率分別為(54.5±4.79)%、(57.1±3.85)%和(64.5±3.01)%，結(jié)果見表3。

表3 HPLC法測定血漿中纈沙坦的提取回收率Table 3 Extraction recovery in determination of valsartan in human plasma by HPLC method

2.2.5 穩(wěn)定性考察

血漿樣品經(jīng)-20 ℃反復(fù)3次凍融，預(yù)處理后室溫放置24 h，-20 ℃冰凍放置1個(gè)月后，測定樣品濃度。結(jié)果顯示所有測定值與初始值的相對(duì)誤差（RE %）均小于15%，說明分析測試過程中的樣品較為穩(wěn)定，結(jié)果見表4、表5和表6。

本試驗(yàn)采取HPLC法測定人血漿樣品中纈沙坦?jié)舛?，結(jié)果表明，血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾待測物的測定。本方法具有快速、專屬、準(zhǔn)確、靈敏度高德特點(diǎn)，適合纈沙坦的藥代動(dòng)力學(xué)研究。

表4 HPLC法測定血漿中纈沙坦的穩(wěn)定性（-20 ℃反復(fù)3次凍融）Table 4 The stability of sample in the determination of valsartan by HPLC method（after three times freezing and thawing at -20 ℃）

表5 HPLC法測定血漿中纈沙坦的穩(wěn)定性（室溫放置24 h）Table 5 The stability of sample in the determination of valsartan by HPLC method （before and after placing 24 h at room temperature）

表6 HPLC法測定血漿中纈沙坦的穩(wěn)定性（-20 ℃冰凍放置1個(gè)月）Table 6 The stability of sample in the determination of valsartan by HPLC method(after freezing for one month at -20 ℃)

2.3 纈沙坦膠囊藥代動(dòng)力學(xué)的研究

2.3.1 受試者選擇

選擇 20名健康男性志愿者，年齡為（23.4±1.64）歲，體質(zhì)量為（65.2±7.84）kg，體重指數(shù)均在 19～24 內(nèi)。受試者一般體格檢查、心電圖及血尿常規(guī)、肝腎功能等實(shí)驗(yàn)室檢查均為正常。受試者無既往慢性病史，無藥物過敏史，無藥物濫用、酗酒、嗜煙史。試驗(yàn)前3周內(nèi)及試驗(yàn)期間未服用其他藥物，試驗(yàn)前3個(gè)月內(nèi)未獻(xiàn)血或失血，試驗(yàn)前3個(gè)月內(nèi)未參加其它臨床試驗(yàn)。試驗(yàn)前書面告知受試者研究的性質(zhì)、目的和風(fēng)險(xiǎn)，受試者在充分了解的基礎(chǔ)上自愿簽署知情同意書。

2.3.2 給藥方案與樣品采集

20名受試者于試驗(yàn)前1日晚進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)晚餐后，禁食不禁水10 h過夜，試驗(yàn)期間禁飲茶、咖啡及含咖啡因及醇類的飲料，并禁止吸煙。試驗(yàn)當(dāng)日晨起空腹口服纈沙坦膠囊 1片（代文，相當(dāng)于纈沙坦 80 mg），用200 mL溫開水送服，給藥后2 h后可進(jìn)統(tǒng)一早餐，4 h后進(jìn)統(tǒng)一清淡午餐，其間飲水適量。于服藥前和服藥后0.5，1.0，1.5，2.0，3.0，4.0，6.0，8.0，12.0，24.0，30.0 h分別采取前臂靜脈血5 mL，置入肝素化離心試管中，離心（3 500 r·min-1）10 min，分離血漿，血漿于－20 ℃冷凍保存。

2.3.3 藥代動(dòng)力學(xué)結(jié)果

20名健康受試者口服纈沙坦膠囊1粒后在規(guī)定時(shí)間內(nèi)進(jìn)行血樣采集，用HPLC法對(duì)采集到的血漿樣品進(jìn)行血藥濃度測定，結(jié)果見表 7，所得血藥濃度-時(shí)間曲線見圖2。

表7 20名健康受試者口服纈沙坦膠囊的藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 7 Pharmacokinetics parameters of oral administration valsartan capsule

圖2 20名受試者口服纈沙坦膠囊的平均藥濃度-時(shí)間曲線Fig.2 Mean drug concentration-time curve of oral administration valsartan capsule

3 結(jié) 論

纈沙坦的HPLC分析方法已有多篇報(bào)道[3-10]。

本次實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法，其方法用來測定血漿中纈沙坦?jié)舛?、研究血漿中纈沙坦的藥代動(dòng)力學(xué)，測定了20名健康男性志愿受試者口服纈沙坦膠囊后的不同時(shí)刻血漿中纈沙坦的濃度，并根據(jù)測定結(jié)果求算纈沙坦的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)為與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。

纈沙坦分散片的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)：Tmax為(2.3±0.7)h；Cmax為(2 457±1 413)ng·mL-1；T1/2為(5.8±1.1)h；AUC0-t為(14 390±7 040)ng·h·mL-1；AUC0-∞為 (14 736±7 161)ng·h·mL-1。

［1］曹文，凌樹森，張啟高，等. 血管緊張素轉(zhuǎn)換酶基因多態(tài)性與原發(fā)性高血壓及血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制降壓作用[J]. 藥學(xué)通報(bào)，1999，84(9)：655-657.

［2］謝燕，李聲宏，沈蕾,等. 纈沙坦在慢性腎小球腎炎病人中的應(yīng)用[J]. 中國新藥與臨床雜志，2001, 20(6)：427-430.

［3］SIOUFI A，MARFIL F，JAOUEN A，et al. The effect of age on the pharmacokinetics of valsartan[J]. Biopharm Drug Dispos ，1998，19(4)：237-244.

［4］李曄，趙志剛，陳旭，等. 高效液相色譜法測定纈沙坦的血漿藥物濃度[J]. 藥物分析雜志2000， 20（6）：404-406.

［5］許長江，劉驍，王海學(xué)，等. 纈沙坦膠囊在人體的藥物動(dòng)力學(xué)及相對(duì)生物利用度[J]. 中國臨床藥學(xué)雜志，2002，11（2）：91-94.

［6］宮文會(huì)，李高，斯陸勤，等. 食物對(duì)復(fù)方纈沙坦片中纈沙坦人體藥動(dòng)學(xué)特征的影響[J]. 中國藥師，2005，8（12）：988-990.

［7］Daneshtalab N，Lewanczuk RZ，Jamali F. High2performance liquid chromatographic analysis of angiotensin II receptor antagonist valsartan using a liquid extraction method[J]. J Chromatogr B，2002 ,766 （6）：345-349.

［8］趙志剛，李曄，陳旭，等. 纈沙坦膠囊生物等效性研究[J]. 中國藥學(xué)雜志，2002，37（9）：686-689.

［9］Gonzalez L，Lopez JA，Alonso RM. Fast screening method for the determination of angiotensin II receptor antagonists in human plasma by high2performance liquid chromatography with fluorimetric detection[J]. J Chromatogr A，2002，949（122）：49-60.

［10］Sioufi A，Marfil F，Godbillon J. Automated determination of an an2 giotensin Ⅱ receptor antagonist , CGP48 933 , in plasma by high performance liquid chromatography. [J]. Liq Chromatogr，1994，17（10）：2179-2186.