申瑞瑞, 李亞柯, 王伯華

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紅茶菌發(fā)酵液抑菌活性的研究

申瑞瑞1, 李亞柯1, 王伯華*2

(1. 湖南文理學(xué)院 芙蓉學(xué)院, 湖南 常德, 415000; 2. 湖南文理學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，湖南 常德，415000)

紅茶菌發(fā)酵液是由茶糖水發(fā)酵制成的茶飲料, 紅茶菌膜為細(xì)菌、酵母和真菌組成的共生菌. 紅茶菌發(fā)酵液成分比較復(fù)雜, 采用紙片法和牛津杯法測試了K-A紅茶菌發(fā)酵液對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的抑菌效果, 結(jié)果顯示它對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑制作用. 抑菌活性主要由有機(jī)酸和某種對熱敏感的物質(zhì)提供. 研究還發(fā)現(xiàn)不同來源的K-A紅茶菌和K-H紅茶菌發(fā)酵特征差異顯著.

紅茶菌; 發(fā)酵液; 抑菌活性

紅茶菌(Kombucha)是一種由酵母菌、醋酸菌和乳酸菌組成的共生菌, 用它發(fā)酵茶糖水可以制成略帶甜酸風(fēng)味的茶飲料[1], 其是我國一種歷史悠久的民間傳統(tǒng)飲料. 近年來, 對紅茶菌保健功能的研究發(fā)現(xiàn)它具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、促進(jìn)消化等功能[2—3]. 近年來, 科研人員都將其作為天然產(chǎn)物的資源庫加以開發(fā)利用[4].

本研究以K-A紅茶菌為研究對象, 測試其發(fā)酵液對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果, 并初步分析抑菌物質(zhì)的耐熱性. 同時比較了不同來源的K-A紅茶菌和K-H紅茶菌的發(fā)酵特征, 以期為紅茶菌發(fā)酵液中抑菌活性物質(zhì)的開發(fā)利用提供理論依據(jù).

1 材料

1.1 菌種

紅茶菌K-A購自安徽省; 紅茶菌K-H購自黑龍江省; 供試菌株大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌均由湖南文理學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室從腐敗的食品中分離獲取并保藏.

1.2 菌種培養(yǎng)

紅茶菌的培養(yǎng)[5]: 在沸水中加入0.5%的紅茶, 浸泡10 min后濾渣, 加入10%的蔗糖, 121 ℃滅菌15 min即得茶糖水, 冷卻后接入一小塊紅茶菌菌膜, 30 ℃培養(yǎng)7～10 d.

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的培養(yǎng): 均采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(牛肉膏0.3%、蛋白胨1%、氯化鈉0.5%、瓊脂2%), 37℃培養(yǎng)3～5 d.

1.3 主要儀器

pH測定儀(pH3110)、超凈工作臺(SW-CJ-IF*)、低速離心機(jī)(TDL-40B*)、手提式壓力蒸汽滅菌器(YX280B*)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE-52C)、電熱恒溫干燥箱(DHG-9140)、電熱恒溫水浴鍋(HH-S4).

2 方法

2.1 供試菌菌懸液的制備

從大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的斜面培養(yǎng)基上用接種環(huán)適量挑取幾環(huán)菌體, 加到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中, 置于37 ℃培養(yǎng)箱180 rpm振蕩培養(yǎng)24 h, 將菌懸液的OD480 nm調(diào)整至0.5～0.6后備用[6].

2.2 抑菌試驗(yàn)

2.2.1 濾紙片法

用打孔器把濾紙片打成直徑為6 mm的濾紙片, 滅菌后分別吸取待測液體, 然后用無菌鑷子把濾紙片放在涂布有供試菌懸液的培養(yǎng)基上, 置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36～48 h, 觀察抑菌圈的大小并做記錄.

2.2.2 牛津杯法

把已滅過菌的牛津杯用鑷子固定在涂布有一定量供試菌懸液的培養(yǎng)基上, 分別向牛津杯中加入100 μL的待測液體, 置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36～48 h, 觀察抑菌圈的大小并做記錄.

2.3 紅茶菌發(fā)酵液的熱處理

用試管取一定量培養(yǎng)至第8天的紅茶菌發(fā)酵液, 放入100℃的水浴鍋內(nèi)進(jìn)行熱處理15 min, 使發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)變性.

2.4 紅茶菌發(fā)酵液的濃縮

取培養(yǎng)至第8天的紅茶菌發(fā)酵液, 4 000 rpm離心5 min, 取上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在50 ℃條件下將發(fā)酵液濃縮至原體積的一半.

3 結(jié)果

表1 K-A紅茶菌發(fā)酵液對3種細(xì)菌的抑菌效果

3.1 紅茶菌發(fā)酵液對供試細(xì)菌的抑制作用

取培養(yǎng)8 d的K-A紅茶菌發(fā)酵液, 采用濾紙片法和牛津杯法分別對大腸桿菌(G-)、枯草芽孢桿菌(G+)、金黃色葡萄球菌(G+)進(jìn)行抑菌試驗(yàn), 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示. 從表1可知, K-A紅茶菌液對3種供試細(xì)菌有明顯地抑制作用, 說明紅茶菌發(fā)酵液對G+細(xì)菌、G-細(xì)菌均有抑制作用. 從表1還可看出牛津杯法抑菌試驗(yàn)中對抑菌圈的觀察效果比濾紙片法更顯著, 所以后續(xù)抑菌試驗(yàn)均采用牛津杯法進(jìn)行.

3.2 紅茶菌發(fā)酵液中抑菌物質(zhì)的初篩

紅茶菌發(fā)酵液成分復(fù)雜, 且含部分具有抑菌活性的物質(zhì), 如紅茶水中的茶多酚[7], 發(fā)酵過程中產(chǎn)生的乙酸等有機(jī)酸. 為了尋找K-A紅茶菌發(fā)酵過程中是否產(chǎn)生了其它潛在的抑菌成分, 將未發(fā)酵的茶糖水、相同pH值的乙酸溶液與K-A紅茶菌發(fā)酵液做了如下對照試驗(yàn), 結(jié)果見表2.

從表2可以看出, 本實(shí)驗(yàn)中不經(jīng)發(fā)酵的茶糖水對供試菌都沒有抑制作用, 排除了茶水中含有抑菌物質(zhì), 有研究指出紅茶菌發(fā)酵所用的茶糖水中所含的茶多酚具有抑菌效果, 這可能與制備茶糖水時所采用的茶葉品種有關(guān)[8].

表2 K-A紅茶菌發(fā)酵液與茶糖水及相同pH值的醋酸溶液抑菌效果比較

試驗(yàn)所用的紅茶菌液為發(fā)酵8 d的菌液(pH = 2.4), 由于有機(jī)酸的酸堿平衡常數(shù)相差較大, 故采用了與紅茶菌液相同酸度的冰醋酸溶液進(jìn)行試驗(yàn). 從表2可以看出, 2者的抑菌作用較相近, 冰醋酸的抑菌作用略強(qiáng), 這與冰醋酸本身就具有較強(qiáng)的抑菌效果有關(guān)[9], 和謝俊杰的研究結(jié)果一致[4].

3.3 紅茶菌發(fā)酵液中抑菌物質(zhì)的熱穩(wěn)定性分析

對紅茶菌發(fā)酵液進(jìn)行100 ℃熱處理15 min以鈍化可能存在的熱敏性抑菌物質(zhì). 用熱處理及未經(jīng)熱處理的紅茶菌發(fā)酵液分別對供試菌做抑菌試驗(yàn), 結(jié)果如表3所示.

表3 K-A紅茶菌發(fā)酵液熱處理前后抑菌效果比較

從表3可以觀察到經(jīng)過熱處理的紅茶菌發(fā)酵液的抑菌圈明顯小于未經(jīng)熱處理的發(fā)酵液, 由于發(fā)酵液中的酸性物質(zhì)被揮發(fā)出來, 所以紅茶菌發(fā)酵液中存在對熱敏感的抑菌物質(zhì), 可能是多肽類或蛋白質(zhì)類物質(zhì), 這與Sreeramulu G和張虎成的研究結(jié)果是一樣的[10—11].

3.4 熱處理的紅茶菌發(fā)酵液濃縮后的抑菌效果

通過旋轉(zhuǎn)蒸餾法將熱處理的紅茶菌發(fā)酵液體積濃縮至原來的1/2, 用NaOH(1 mol/L)調(diào)整pH值至與原發(fā)酵液一致, 所得濃縮發(fā)酵液對3種供試細(xì)菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn), 試驗(yàn)結(jié)果如表4所示.

表4 熱處理的K-A紅茶菌發(fā)酵液濃縮前后抑菌效果比較

將熱處理的紅茶菌發(fā)酵液濃縮后, 觀察到其對3種供試細(xì)菌的抑菌圈明顯增大, 結(jié)合3.3節(jié)中的結(jié)果—經(jīng)熱處理的紅茶菌液對供試菌的抑菌圈明顯減小, 酸性物質(zhì)被揮發(fā), 可以推斷紅茶菌發(fā)酵液中存在著除有機(jī)酸之外的抑菌活性物質(zhì), 且該抑菌物質(zhì)對熱敏感.

3.5 不同地區(qū)的紅茶菌發(fā)酵特征比較

紅茶菌是由醋酸菌、酵母菌和乳酸菌等多種微生物組成的共生菌, 也有研究報道用于發(fā)酵培養(yǎng)紅茶菌的微生物主要是醋酸菌和酵母菌, 未分離到乳酸菌[12]. 本試驗(yàn)收集到了安徽省和黑龍江省的紅茶菌菌膜, 并對它們的發(fā)酵特征進(jìn)行了比較, 具體見表5. 從表5中可以看出, 不同來源的紅茶菌發(fā)酵特征差異很大, 說明其微生物組成存在差異, 也暗示了它們在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物各不相同.

表5 K-A紅茶菌和 K-H紅茶菌發(fā)酵特征比較

4 討論

K-A紅茶菌發(fā)酵茶糖水8 d后對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌均有明顯的抑菌作用, 而未經(jīng)發(fā)酵的茶糖水沒有顯示出抑菌活性, 表明紅茶菌發(fā)酵液中的確存在抑菌物質(zhì), 這與謝俊杰等[4]人的研究結(jié)果相同. 通過熱處理試驗(yàn)和低溫濃縮試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)紅茶菌發(fā)酵液中可能存在對熱敏感的抑菌活性物質(zhì), 例如多肽類或蛋白類物質(zhì), 這為進(jìn)一步研究紅茶菌發(fā)酵液中的抑菌物質(zhì)明確了方向.

試驗(yàn)還比較了源自安徽省和黑龍江省的紅茶菌種, 發(fā)現(xiàn)它們的發(fā)酵特征及抑菌活性差異很大. 收集更多區(qū)域的紅茶菌種, 測試它們的抑菌效果, 尋找更多的可能應(yīng)用于食品防腐的抑菌物質(zhì), 是下一步的研究方向.

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On antibacterial activities of Kombucha fermentation

SHEN Rui-rui1, LI Ya-ke1, WANG Bo-hua2

(1. Furong College of Hunan University of Arts and Science, Changde 415000, China; 2. College of Life Sciences, Hunan University of Arts and Science, Changde 415000, China)

Kombucha fermentation is a beverage obtained by the fermentation of sweetened tea. It’s fermented by a symbiotic culture of bacteria, yeast and fungi. Its chemical composition is complex. K-A kombucha fermented culture showed large inhibition zones against,andby paper disk method and oxford cup method. The results showed that it had evident inhibition effect on growth of both G+bacteria and G-bacteria. And it was found that the antibacterial activity observed is due to not only organic acids, but also other thermosensitive components. The fermentation traits differences between K-A kombucha and K-H kombucha were significant.

Kombucha; fermentation broth; antibacterial activities

10.3969/j.issn.1672-6146.2013.04.007

Q 934

1672-6146(2013)04-0029-04

email: wangbohua0731@yahoo.com.cn;

email: 412003811@qq.com.

2013-10-31

湖南文理學(xué)院2012年度大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)研究項(xiàng)目及湖南省“十二五”重點(diǎn)建設(shè)學(xué)科資助

(責(zé)任編校: 江 河)