楊秀芳，汪洋，馬養(yǎng)民

（陜西科技大學(xué)教育部輕化工助劑化學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西西安 710021）

杜仲（Eucommia ulmoides Olive）為杜仲科杜仲屬植物，僅一屬一種。杜仲在我國研究和利用已有兩千多年的歷史[1]。傳統(tǒng)中醫(yī)以皮入藥，但樹皮生長緩慢，種植10年～20年后才能剝皮，每年杜仲皮的增長量僅為0.4 kg左右，緊缺的藥源無法滿足人類的需求[2]。為了保護(hù)和擴(kuò)大藥源，杜仲以葉代皮研究日益活躍，研究發(fā)現(xiàn)杜仲葉與皮有著相似的藥理作用和化學(xué)成分，杜仲葉在臨床上也具有較好的療效[3]。杜仲屬于落葉喬木，杜仲葉具有廉價(jià)、采摘方便、可循環(huán)再生等特點(diǎn)。這為杜仲葉的進(jìn)一步利用奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)，也為緩解緊缺的杜仲資源開辟了途徑[4]。

杜仲葉中富含活性化合物綠原酸，綠原酸又稱3－咖啡?？崴?，是一種廣泛分布于植物體內(nèi)的苯丙素類物質(zhì)。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)其具有抗菌、抗炎、保肝、利膽等多種功效，廣泛的應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、日用化工等行業(yè)，對(duì)綠原酸的提取純化為合理開發(fā)杜仲資源具有十分重要的意義[5]。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)杜仲葉中綠原酸提取工藝和分離純化方法進(jìn)行了研究，進(jìn)一步為杜仲綜合利用提供參考。

1 儀器、試劑與材料

1.1 儀器與設(shè)備

SENCO電熱恒溫浴鍋：上海申生科技有限公司；RE52CS－1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：鄭州南北儀器設(shè)備有限公司；Unic－2100型紫外可見光分光光度計(jì)：尤尼柯上海儀器有限公司；X－6精密顯微微量熔點(diǎn)測定儀：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；Bruker avanceⅢ－400Hz超導(dǎo)核磁共振儀：瑞士布魯克公司。

1.2 材料與試劑

杜仲葉、皮均采自西北農(nóng)林科技大學(xué)苗圃；綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品：中國藥品生物制品檢驗(yàn)所；D－101大孔吸附樹脂：山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司；柱層析硅膠：青島海立信精細(xì)硅膠化工有限公司；薄層層析硅膠G：青島久隆盛業(yè)硅膠干燥劑有限公司；Sephadex LH－20：上海寶曼生物科技有限公司；甲醇、乙酸（色譜純）。

2 方法和結(jié)果

2.1 綠原酸水提工藝研究

2.1.1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

準(zhǔn)確稱取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品2.5 mg，甲醇溶解并定容至50 mL，得到綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.05 g/L）。分別從標(biāo)準(zhǔn)溶液中精確移取 1、2、3、4、5、7 mL 溶液至 10 mL 容量瓶中，甲醇定容，紫外分光光度計(jì)于328 nm處測定其吸光度[6]。以綠原酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程。

2.1.2 水提法正交試驗(yàn)

以水提法作為杜仲葉中綠原酸的提取方法。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取料液比、提取時(shí)間、提取溫度為考察因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，正交因素設(shè)計(jì)見表1。

準(zhǔn)確稱取陰干粉碎后的杜仲葉2 g，以水為溶劑，按正交水平表的工藝條件提取2次。提取液過濾并減壓蒸干，用甲醇溶解，過濾除去不溶物。將濾液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，甲醇定容。再從上述容量瓶中精確移取1 mL溶液到100 mL容量瓶中，定容，利用紫外可見光分光光度計(jì)測其吸光度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出綠原酸含量并計(jì)算得率。

表1 正交因素表Table 1 Factors of orthogonal experiments

2.1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

依據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，建立回歸方程。

圖1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of chlorogenic acid

由標(biāo)準(zhǔn)曲線可知，綠原酸在5mg/L～35mg/L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為：y=0.061 4x－0.056 39，r=0.999 79，SD=0.015 26。水提法提取綠原酸正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Result of orthogonal experiments

極差分析表明，各因素對(duì)綠原酸得率的影響程度為：C＞A＞B，即提取溫度對(duì)綠原酸得率影響最大，其次是料液比，影響最小的因素是提取時(shí)間。比較A、B、C等因素的K1、K2和K3數(shù)據(jù)，3個(gè)因素的最優(yōu)組合是A2B1C2，即綠原酸水提法的最佳工藝條件是：料液比為1∶8，提取時(shí)間 70 min，提取溫度 80℃，以熱水作為溶劑提取杜仲葉2次，測得此條件下的綠原酸得率為1.78%。

2.2 綠原酸的純化工藝研究

2.2.1 綠原酸的純化

將杜仲葉陰干并粉碎，按2.1.3確定的最佳工藝進(jìn)行提取。將提取物減壓濃縮得到粗提物。向粗提物中添加等量的工業(yè)酒精，經(jīng)過多次的攪拌、沉淀，乙醇部分合并，減壓濃縮至無乙醇蒸出。通過此操作除去浸膏中大量的多糖、淀粉、蛋白質(zhì)等得粗浸膏。利用D－101大孔吸附樹脂純化所得粗浸膏，水－乙醇進(jìn)行梯度洗脫，收集水相部分，減壓濃縮得到浸膏。利用硅膠柱層析進(jìn)一步對(duì)浸膏進(jìn)行純化。以乙酸乙酯－甲醇進(jìn)行梯度洗脫（乙酸乙酯－甲醇體積比分別為 1∶0，20∶1，10∶1，5∶1，10∶3，5∶2，2∶1，5∶3，10∶7，1∶1，0∶1），利用薄層層析，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)化合物進(jìn)行比較。經(jīng)薄層層析后發(fā)現(xiàn)5∶2梯度洗脫液含有與綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品相同Rf值的斑點(diǎn)。經(jīng)多次硅膠柱層析后，再以甲醇為洗脫劑，利用Sephadex LH－20凝膠柱層析進(jìn)行純化。收集、合并與標(biāo)準(zhǔn)品具有相同Rf值斑點(diǎn)的洗脫液，揮干洗脫劑后得到白色固體。

2.2.2 化合物純度檢測與結(jié)構(gòu)鑒定

以不同極性的展開劑將上述白色固體進(jìn)行薄層層析，顯色后在紫外燈下進(jìn)行觀察，看是否呈現(xiàn)單一斑點(diǎn)，若始終呈現(xiàn)單一的特征斑點(diǎn)；或利用熔點(diǎn)儀測定熔點(diǎn)，若熔程較短且與文獻(xiàn)值相符，可確定為純品化合物。

同時(shí)，利用1H－NMR、13C－NMR等波譜技術(shù)進(jìn)行分析測定，確定化合物的結(jié)構(gòu)。

2.2.3 結(jié)果

2.2.3.1 純度的檢測

分離得到的白色固體，易溶于乙醇、丙酮等極性溶劑，難溶于氯仿等低極性溶劑。經(jīng)檢測其熔點(diǎn)為207℃～208℃，與綠原酸的熔點(diǎn)相同，向白色固體中加入少量綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品，其熔點(diǎn)不發(fā)生變化。同時(shí)薄層色譜呈現(xiàn)出單一斑點(diǎn)，且與標(biāo)準(zhǔn)品有相同的Rf值，由此可初步確定白色固體為綠原酸。

2.2.3.2 結(jié)構(gòu)鑒定

1H－NMR（400 Hz，DMSO－d6）δ：12.45（1H，s，H－7′）為羧基氫的信號(hào)峰；9.63（1H，s，H－4），9.19（1H，s，H－3）為苯環(huán)上羥基氫的信號(hào)峰；7.04（1H，d，J=1.8，H－2），7.00 （1H，dd，J=1.8Hz，8.2Hz，H －5），6.78 （1H，d，J=8.1Hz，H－6）為苯環(huán)上未被取代的氫原子信號(hào)峰；7.44（1H，d，J=15.9 Hz，H－7），6.17（1H，d，J=15.9 Hz，H－8）為烯基氫的信號(hào)峰；5.57，4.98，4.81為與六元環(huán)直接相連的羥基氫信號(hào)峰；5.08（1H，m，H－3′），3.57（1H，s，H－4′），3.92 （1H，s，H－5′），2.05 （2H，m，H－6′），1.95（2H，m，H－2′）為六元環(huán)上的氫原子信號(hào)峰。

13C－NMR （100 Hz，DMSO－ d6）δ：126.02 （C－1），116.17（C－2），148.79（C－3），145.43（C－4），115.20（C－5），121.84（C－6）為苯環(huán)上的六個(gè)碳原子的信號(hào)峰；146.00（C－7），114.69（C－8）為烯基碳的信號(hào)峰；166.17（C－9）為酯基碳的信號(hào)峰；73.84（C－1′），37.63（C－2′），68.42（C－3′），71.34（C－4′），70.68（C－5′），36.54（C－6′）為六元環(huán)上的碳原子信號(hào)峰；175.41（C－7′）為羧基碳的信號(hào)峰。

以上核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]中綠原酸的數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定該白色固體為綠原酸。

3 結(jié)論

研究表明杜仲葉中綠原酸的含量遠(yuǎn)大于其皮中的含量。本文探討了杜仲葉中綠原酸的提取工藝，為開發(fā)利用該資源提供了有益的參考。杜仲葉中綠原酸的最佳水提工藝條件為：料液比1∶8，提取時(shí)間70 min，提取溫度80℃，以水作為溶劑提取杜仲葉2次，測得此條件下的綠原酸得率為1.78%。粗提物經(jīng)醇沉工藝除雜后，依次利用D－101大孔吸附樹脂、硅膠柱層析、Sephadex LH－20凝膠柱層析對(duì)所得浸膏進(jìn)行純化，分離得到的化合物經(jīng)1H－NMR、13C－NMR波譜鑒定和文獻(xiàn)對(duì)比為綠原酸。

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