劉亞蒙 王緒棟 王兆輝 孫 燕 常光妮 孫俊霞 羅榮華▲

1.山東省泰安市第四人民醫(yī)院兒童血液病房，山東泰安 271000；2.青島大學(xué)附屬泰安市中心醫(yī)院血液病診療中心兒童血液病房，山東泰安 271000

急性白血病是兒童常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，聯(lián)合化療是治療白血病的常用方法，化療時及化療后患兒腹痛、腹瀉等消化道不良反應(yīng)發(fā)生率較高，在隨機臨床試驗中，化療相關(guān)性腹瀉發(fā)生率為5%～47%。有研究表明，80%初診的急性白血病患兒在化療前即存在消化道黏膜損傷，化療藥物可不同程度地加重腸黏膜損傷，引起腸黏膜屏障功能的破壞以及腸道菌群失調(diào)，從而導(dǎo)致腹瀉。如何有效保護(hù)急性白血病患兒腸黏膜屏障功能、調(diào)節(jié)腸道菌群是預(yù)防和治療化療相關(guān)性腹瀉的關(guān)鍵。近年來益生菌制劑因可調(diào)控腸道微生態(tài)，維持胃腸道菌群動態(tài)平衡，調(diào)節(jié)腸道功能等作用逐漸被臨床重視。本研究應(yīng)用雙歧桿菌三聯(lián)活菌膠囊治療急性白血病患兒化療相關(guān)性腹瀉，對照觀察患兒腹瀉時間、 腸道菌群及腸道黏膜屏障功能的變化，以期為臨床治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年3月至2021年3月在青島大學(xué)附屬泰安市中心醫(yī)院血液病診療中心兒童血液病房初治急性白血病化療相關(guān)性腹瀉患兒50 例作為研究對象， 按照隨機數(shù)字表法將其分為試驗組和對照組，每組各25 例。試驗組中，男13 例，女12 例；年齡（6.56±3.86）歲；腹瀉分級：Ⅱ級5 例，Ⅲ級17 例，Ⅳ級3 例。對照組中，男14 例，女11 例；年齡（6.74±4.10）歲；腹瀉分級：Ⅱ級6 例，Ⅲ級16 例，Ⅳ級3 例。兩組患兒的一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)（20170421），患兒監(jiān)護(hù)人均知情同意，并簽署知情同意書。試驗組中3 例患兒入組5 d 后因化療后Ⅳ度骨髓抑制退出研究，未納入療效分析。納入標(biāo)準(zhǔn)：①診斷為初發(fā)急性白血病患兒；②年齡2～18 歲，主要器官功能無嚴(yán)重障礙；③病情穩(wěn)定，全身主要臟器功能基本正常；④無代謝性疾??；⑤具有語言交流能力或有家長陪同。排除標(biāo)準(zhǔn)：①根據(jù)世界衛(wèi)生組織骨髓抑制程度分級標(biāo)準(zhǔn)，患兒出現(xiàn)Ⅳ度骨髓抑制（白細(xì)胞計數(shù)＜1.0×10/L、中性粒細(xì)胞計數(shù)＜0.5×10/L）者；②極度營養(yǎng)不良的患兒；③重癥感染患兒；④嚴(yán)重消化不良或吸收不良患兒；⑤對益生菌制劑過敏的患兒。

1.2 方法

本研究兩組患兒均給予靜脈補液等對癥支持治療，試驗組在此基礎(chǔ)上口服雙歧桿菌三聯(lián)活菌腸溶膠囊（晉城海斯制藥有限公司，批號：S19993065），1 粒/次，2～3 次/d，患兒出現(xiàn)Ⅳ度骨髓抑制時停用退出研究，共治療2 周。

1.3 觀察指標(biāo)及評價標(biāo)準(zhǔn)

比較兩組患兒的腹瀉天數(shù)，治療前、治療2 周后糞便中雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、大腸埃希菌菌落數(shù)，血漿內(nèi)毒素及D-乳酸含量、糞便鈣衛(wèi)蛋白水平。①腸道菌群檢測：在治療前、治療2 周時評估兩組患兒糞便中雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、大腸埃希菌菌落數(shù)。治療前、治療2 周取患兒1 g 新鮮糞便逐漸稀釋至10倍，分別接種于雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、大腸埃希菌培養(yǎng)基中（培養(yǎng)基均購自青島海博生物技術(shù)有限公司），恒溫培養(yǎng)24～72 h 后，采用平板菌落計數(shù)法對不同培養(yǎng)基中相對應(yīng)的雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、大腸埃希菌菌落數(shù)進(jìn)行計算和比較。②腸道屏障功能指標(biāo)評估：在治療前、 治療2 周評估兩組患兒腸道屏障功能指標(biāo)，包括血漿內(nèi)毒素及D-乳酸含量、糞便鈣衛(wèi)蛋白。治療前、 治療2 周兩組患兒抽取靜脈血3 ml 送檢血漿內(nèi)毒素及D-乳酸含量，內(nèi)毒素采用偶氮顯色法，按照內(nèi)毒素鱟試劑盒（上海伊華臨床醫(yī)學(xué)科技公司）使用說明測定血漿內(nèi)毒素含量；D-乳酸采用改良分光光度法，按照D-乳酸半定量法試劑盒（美國Sigma 公司）使用說明測定血漿D-乳酸含量。治療前、治療2 周兩組患兒取糞便檢測糞便鈣衛(wèi)蛋白，糞便鈣衛(wèi)蛋白按照鈣衛(wèi)蛋白檢測試劑盒（膠體金法）（珠海市醫(yī)友生物科技有限公司）說明書進(jìn)行糞便標(biāo)本采樣檢測。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組患兒腹瀉時間的比較

試驗組患兒的腹瀉時間為（5.05±1.84）d，短于對照組的（7.04±2.17）d，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.375，P=0.002）。

2.2 兩組患兒治療前后腸道菌群中細(xì)菌菌落數(shù)的比較

治療前，兩組患兒的腸道菌群中細(xì)菌菌落數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；試驗組患兒治療2 周后糞便中雙歧桿菌、 嗜酸乳桿菌菌落數(shù)多于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；試驗組患兒治療2 周后糞便中大腸埃希菌菌落數(shù)少于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）； 試驗組患兒治療2 周后糞便中雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌菌落數(shù)多于治療前，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；試驗組患兒治療2 周后糞便中大腸埃希菌菌落數(shù)與治療前比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；對照組患兒治療2 周后糞便中雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌菌落數(shù)少于治療前，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；對照組患兒治療2 周后糞便中大腸埃希菌菌落數(shù)多于治療前，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。

表1 兩組患兒治療前后腸道菌群中細(xì)菌菌落數(shù)的比較（×107CFU/g，±s）

2.3 兩種患兒治療前后腸道屏障功能指標(biāo)檢測結(jié)果的比較

治療前， 兩組患兒的腸道屏障功能指標(biāo)檢測結(jié)果比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；試驗組患兒治療2 周后的血漿內(nèi)毒素、D-乳酸及糞便鈣衛(wèi)蛋白水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；試驗組患兒治療2 周后的血漿內(nèi)毒素、D-乳酸及糞便鈣衛(wèi)蛋白水平高于治療前，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；對照組患兒治療2 周后的血漿內(nèi)毒素、D-乳酸及糞便鈣衛(wèi)蛋白水平高于治療前，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表2）。

表2 兩種患兒治療前后腸道屏障功能指標(biāo)檢測結(jié)果的比較（±s）

3 討論

化療相關(guān)性腹瀉是指化療期間，出現(xiàn)在化療時或化療后的伴或不伴輕度腹痛的腹瀉?；熛嚓P(guān)性腹瀉是急性白血病患兒化療過程中常見的并發(fā)癥，腹瀉不僅干擾治療還可能影響預(yù)后。多項研究表明，化療引起的腸黏膜屏障功能受損、腸道菌群紊亂及腸道感染等因素與化療相關(guān)性腹瀉密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，試驗組患兒的腹瀉天數(shù)短于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示補充益生菌可緩解急性白血病患兒化療相關(guān)性腹瀉，與國內(nèi)王朝榮等研究一致，國外Reyna-Figueroa 等進(jìn)行了一項前瞻性研究，化療期急性白血病患兒中口服益生菌組有30%的患兒發(fā)生化療相關(guān)性腹瀉，而未服用益生菌的患兒中出現(xiàn)胃腸道癥狀為63%（P=0.009）， 因此口服益生菌可以改善化療患兒的胃腸道不良反應(yīng)，減輕化療帶來的不良影響， 降低化療相關(guān)性腹瀉的發(fā)生率。Reyna-Figueroa 等也證實補充益生菌可減少化療引起的白血病患兒腹痛、腹瀉，這可能與所使用的益生菌復(fù)合制劑雙歧桿菌三聯(lián)活菌膠囊是由雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌和糞腸球菌組成，可以黏附、聚集并定植于腸黏膜上，直接補充益生菌，有利于腸道正常菌群的恢復(fù)有關(guān)。

3.1 腸道菌群與益生菌制劑的使用

腸道內(nèi)的有益菌是人體腸道的主要菌群，如乳桿菌、消化球菌、雙歧桿菌、鼠李糖桿菌等。條件致病菌如大腸埃希菌、脆弱擬桿菌、腸球菌、梭狀芽孢桿菌等通常與宿主互利共生，在腸道菌群達(dá)到平衡時，它們對機體無害，但菌群失衡時，它們會發(fā)生移位而轉(zhuǎn)變成有害菌導(dǎo)致機體致病?；熛嚓P(guān)性腹瀉患兒常存在腸道菌群失調(diào)，腸道菌群的多樣性下降，腸球菌等條件致病菌的過度生長。本研究結(jié)果顯示，試驗組患兒治療2 周后糞便中的雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌菌落數(shù)多于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；試驗組患兒治療2 周后糞便中大腸埃希菌菌落數(shù)少于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示雙歧桿菌三聯(lián)活菌膠囊可能能夠改善化療相關(guān)性腹瀉患兒的腸道菌群結(jié)構(gòu)，提高腸道有益菌比例。大腸埃希菌為急性白血病患兒血流感染發(fā)生率最高的革蘭氏陰性桿菌，感染后易引起敗血癥、 化膿性腦膜炎等嚴(yán)重感染性疾病。劉寧等在研究中發(fā)現(xiàn)，白血病腹瀉患兒血流感染的病原菌大多為革蘭氏陰性桿菌和腸球菌屬細(xì)菌，某些腸球菌可能具有免疫刺激和促炎作用，會對腸道造成嚴(yán)重的炎癥和免疫介導(dǎo)的損傷。本研究雙歧桿菌三聯(lián)活菌膠囊的使用顯著增加了腸道中嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌的含量，逆轉(zhuǎn)了急性白血病化療患兒腸道有益菌含量減少，條件致病菌增加的腸道菌群結(jié)構(gòu)改變的現(xiàn)象，這與益生菌能選擇性地調(diào)節(jié)腸道菌群的組成，增加益生菌，減少某些致病菌，在一定程度上改善菌群紊亂有關(guān)。

3.2 腸道黏膜屏障功能損傷與益生菌制劑的使用

本研究監(jiān)測了腸道黏膜屏障功能損傷的指標(biāo)內(nèi)毒素、D-乳酸及腸道炎癥指標(biāo)糞便鈣衛(wèi)蛋白。血漿內(nèi)毒素是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁成分，D-乳酸是胃腸道細(xì)菌的代謝產(chǎn)物，當(dāng)腸黏膜受損時，腸道黏膜通透性上升，內(nèi)毒素、D-乳酸進(jìn)入血液循環(huán)引起其水平明顯上升，因此，血漿內(nèi)毒素、D-乳酸可間接評估腸道黏膜屏障功能。對照組鈣衛(wèi)蛋白、內(nèi)毒素及D-乳酸較試驗組明顯升高，其原因可能與化療可引起消化道不良反應(yīng)及黏膜損傷加重有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，試驗組患兒治療2 周后的血漿內(nèi)毒素、D-乳酸及糞便鈣衛(wèi)蛋白水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示益生菌可以減輕腸道黏膜屏障功能受損。Hueso等通過檢測白血病患兒血漿瓜氨酸濃度及糞便中短鏈脂肪酸水平也證實了化療后腸道黏膜屏障功能受損， 口服益生菌可促進(jìn)緊密連接蛋白及黏蛋白表達(dá)，抑制黏附分子表達(dá)，從而改善腸道屏障功能。動物實驗研究發(fā)現(xiàn)， 給接受5-氟尿嘧啶化療的小鼠服用雙歧桿菌，能夠減少小鼠體重丟失，減輕5-氟尿嘧啶引起的腸道絨毛縮短和隱窩破壞，降低炎癥因子腫瘤壞死因子、白介素-1β 水平，改善化療藥引起的腸道菌群豐度的改變。本研究在化療后嚴(yán)重骨髓抑制期的患兒不推薦使用益生菌，Koyama 等報道了1 例急性白血病化療后嚴(yán)重骨髓抑制期患兒，攝入富含益生菌的酸奶后， 出現(xiàn)感染性休克， 通過菌株特異性PCR 分析確定了病原體與食用酸奶中的菌株相同。益生菌中即使低毒力的菌株也可能在化療后的嚴(yán)重骨髓抑制期致病，故本研究化療后Ⅳ度骨髓抑制的患兒不建議攝入益生菌。

綜上所述，急性白血病患兒出現(xiàn)化療相關(guān)性腹瀉時給予雙歧桿菌三聯(lián)活菌膠囊口服能調(diào)節(jié)腸道菌群，保護(hù)腸道屏障功能，減少腹痛、腹瀉等化療不良反應(yīng)的發(fā)生率。但本研究存在一定局限性：用嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌及大腸埃希菌菌落數(shù)評估腸道菌群，評估內(nèi)容不夠全面；未采用雙盲對照研究，不能避免主觀因素的影響；以上問題將在下一步研究中完善。