趙旭輝　門興元　周成剛

摘要：刺吸電位技術(shù)（electrical penetration graph，簡稱EPG）是昆蟲電生理學(xué)發(fā)展的技術(shù)之一，主要用于研究刺吸式口器昆蟲對寄主植物的取食行為。通過電子轉(zhuǎn)換，將刺吸式昆蟲取食行為中的不同階段以不同的取食波形顯示出來。本文綜述了刺吸電位技術(shù)的發(fā)展歷史、工作原理和植食性盲蝽的取食特點以及不同盲蝽取食行為中的EPG波形變化，同時概述了EPG應(yīng)用中的技術(shù)要點。

關(guān)鍵詞：EPG；植食性盲蝽；取食行為；EPG波形

中圖分類號：S431.9文獻(xiàn)標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2013）07-0133-05

電信號傳遞是生物體內(nèi)信息傳遞的主要方式之一^[1]，對電信號的研究衍生出了電生理學(xué)。作為昆蟲電生理學(xué)研究的常用技術(shù)之一，刺吸電位技術(shù)（electrical penetration graph， EPG）通過記錄刺吸式口器昆蟲口針在寄主組織中的刺探行為引起的電信號變化特征來對昆蟲口針在寄主組織中的位置進(jìn)行準(zhǔn)確定位，從而對刺吸式昆蟲取食行為的不同階段進(jìn)行研究。經(jīng)過不斷的發(fā)展，EPG技術(shù)已經(jīng)成為研究刺吸式口器昆蟲對寄主植物的取食選擇性、取食部位蟲傳病毒的機(jī)制和作物的抗蟲機(jī)制等的重要手段^[2～5]。

EPG技術(shù)最先應(yīng)用于蚜蟲取食行為的研究，此后逐漸應(yīng)用在粉虱和葉蟬等典型刺吸式昆蟲的取食行為研究中。近年來，由于植食性盲蝽類害蟲的大面積暴發(fā)，EPG技術(shù)在植食性盲蝽類害蟲取食行為研究中的應(yīng)用日益增加。在植食性的刺吸類害蟲中，植食性盲蝽類昆蟲屬于細(xì)胞取食者，其取食行為特點與蚜蟲和粉虱等汁液取食者有所不同，因而這兩類昆蟲取食行為的EPG波形有一定的差別，在EPG使用中的技術(shù)要點上也有一些差異。目前EPG技術(shù)在植食性盲蝽取食行為研究中的應(yīng)用尚有較大空間。

1EPG的發(fā)展歷史及其工作原理

1.1EPG的發(fā)展歷史

EPG的原型是1964年美國加利福尼亞大學(xué)McLean和Kinsey設(shè)計的蚜蟲取食監(jiān)測系統(tǒng)（electrical feeding monitor），并依此建立了蚜蟲的取食和分泌唾液的波形記錄，及豌豆蚜取食刺吸行為與電子記錄波形的對應(yīng)關(guān)系，后來又觀察了溫度對刺吸行為的影響^[6～9]。之后歷經(jīng)不少學(xué)者的努力改進(jìn)，最終得以發(fā)展成熟^[10～16]。到了20世紀(jì)80年代中期，EPG技術(shù)與計算機(jī)聯(lián)用，明顯提高了分析效率，之后的絕大多數(shù)EPG 的使用逐步建立在波形基礎(chǔ)上，對昆蟲行為生態(tài)學(xué)進(jìn)行研究，研究對象也擴(kuò)展到包括粉虱、葉蟬、薊馬等在內(nèi)的多種刺吸式昆蟲^[17]。而研究方法也逐步的由單純的EPG系統(tǒng)向著EPG系統(tǒng)與影像監(jiān)測技術(shù)、顯微技術(shù)以及熒光技術(shù)聯(lián)合使用的方向轉(zhuǎn)化，這無疑會使研究更加細(xì)致和深入。

1.2EPG的工作原理

在EPG整個回路中，用水溶性銀膠將一根長2～3 cm、直徑10～20 μm的金線（或鉑金線）的末端粘在昆蟲的前胸背板上^[14]，以此作為昆蟲電極；將一根長約10 cm，直徑約2 mm的銅棒插入到濕潤的土壤中作為植物電極。當(dāng)刺吸式昆蟲口針插入到植物組織中時，整個回路接通，此時用放大器將回路電流輸出成為一系列的輸出電流波譜，將刺吸式昆蟲的取食過程通過電位的形式記錄下來^{[11～13，18]}。

EPG的電勢波動分為電阻（R）成分和電動勢（emf）成分。前者由電阻變化引起，后者由生物電生理變化引起。當(dāng)放大器的輸入電壓改變時，極性和幅度會隨之改變的為R成分，保持不變的為emf成分^{[11～13，18]}。如果整個系統(tǒng)的設(shè)計是基于交流電路，則稱其為 AC-EPG，即交流電型電子取食監(jiān)測儀。AC-EPG的R成分和emf 成分的變換都可引起輸出電壓的變化，目前在美國應(yīng)用較多。若系統(tǒng)用一個不可轉(zhuǎn)換的沒有矯正器或過濾器的中至高輸入電阻（109～1012 Ω）的放大器或使用干電池則為直流電型電子取食監(jiān)測儀（DC-EPG）^{[11，19～21]}，目前歐洲應(yīng)用較多。DC-EPG系統(tǒng)的R成分固定，輸出電壓的變化僅為emf成分，這顯然使輸出的波形更加準(zhǔn)確和細(xì)致^[17]。

2植食性盲蝽的取食特點

植食性盲蝽為刺吸式口器昆蟲，但此類昆蟲屬于細(xì)胞取食者（mesophyll feeder），其取食方式和蚜蟲、粉虱等汁液取食者（vascular feeder）有所不同^[22]。植食性盲蝽主要取食植物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，在取食時先將口針插入植物細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間，然后通過口針的劇烈活動撕碎植物細(xì)胞，在破壞細(xì)胞的同時分泌唾液，將要取食的食物變成泥漿狀物質(zhì)之后再進(jìn)行吸食^[23]。此類昆蟲在吸食了這種泥漿狀的物質(zhì)后，在取食部位植物組織內(nèi)留下一個空洞，造成被害植物組織壞死，形成刺點^[24，25]。

3植食性盲蝽取食行為中的EPG波形

EPG應(yīng)用于盲蝽研究的時間較短，目前使用EPG進(jìn)行過研究的有豆莢草盲蝽^[26]、中黑盲蝽^[27]以及綠盲蝽^[28，29]。

3.1豆莢草盲蝽取食的 EPG波形探究2002 年Cline和Backus首次利用AC-EPG和錄像設(shè)備研究了豆莢草盲蝽在人工飼料上的取食行為，首次對植食性盲蝽類昆蟲的取食行為進(jìn)行了EPG的研究。他們共對豆莢草盲蝽取食行為中的7種行為進(jìn)行了EPG波形的定義，并將波形劃分成了8種，分別命名為A波、B波、C1波、C2波、D波、F波、Z1波以及Z2波，之后又首次通過EPG和錄像設(shè)備對豆莢草盲蝽的口針刺探穿刺行為和其與刺探行為和非刺探行為相關(guān)的外部身體活動進(jìn)行了統(tǒng)計學(xué)分析^[30]。

3.2中黑盲蝽取食的 EPG波形探究蔡曉明等（2008）^[27]用DC-EPG記錄中黑盲蝽雌蟲在菜豆、苜蓿、甘藍(lán)、小麥、棉花等寄主上的取食行為，發(fā)現(xiàn)不同寄主植物上的取食波形大致相同。整個刺探波呈“～”樣的波浪形，大致可分為4部分：Ⅰ波、Ⅱ波、Ⅲ波、Ⅳ波。Ⅰ波表示口針的刺入；Ⅱ波表示口針在撕裂植物組織和細(xì)胞，并分泌唾液；Ⅲ波表示吸食，有Ⅲ1和Ⅲ2兩種表現(xiàn)形式；Ⅳ波表示口針的拔出。此外中黑盲蝽在菜豆、苜蓿上取食的Ⅱ波中鑲嵌有鋸齒狀K波。

3.3綠盲蝽取食的EPG波形探究對綠盲蝽取食行為的EPG波形定義目前有兩種，如圖1和圖2所示。兩者的研究均以棉花作為寄主植物，但前者是以綠盲蝽4齡若蟲為研究對象，后者是以綠盲蝽成蟲為研究對象。所獲得的波形及其定義均以中黑盲蝽取食的EPG波形作為參照且大致相同。

圖1中所示有綠盲蝽取食的5種波形，稱為NP波、A波、M波、H波和B波。 其中NP 波是綠盲蝽口針停留在葉片表面未進(jìn)行刺吸行為的波形；A 波是綠盲蝽以很快速度刺入葉片的波形（0.05～0.2 Hz）； H 波是綠盲蝽刺入組織后，在組織內(nèi)的刺探波形（0.5～1，5～6 Hz）；M 波是口針進(jìn)入韌皮部中破碎細(xì)胞并分泌唾液（0.5～1 Hz）；B波是綠盲蝽在組織內(nèi)部進(jìn)行取食，以及取食完畢后口針拔出（0.5～1、2～3 Hz）。

圖2所示綠盲蝽取食行為的EPG波形與中黑盲蝽取食的EPG波形大體上一致，整個取食過程的EPG呈現(xiàn)“～”狀的波浪形并分為Ⅰ波、Ⅱ波、Ⅲ波、Ⅳ波4個部分。其中Ⅰ波表示綠盲蝽口針開始刺入植物組織；Ⅱ波表示綠盲蝽口針已經(jīng)刺入植物表皮，在撕裂植物組織或細(xì)胞；Ⅲ波表示綠盲蝽在取食細(xì)胞內(nèi)容物；Ⅳ波表示綠盲蝽拔出口針，結(jié)束取食。

4EPG應(yīng)用中的技術(shù)要點

4.1實驗材料的選擇

實驗所選植物應(yīng)長勢良好、莖葉健壯，以盡可能的減少由于實驗材料所導(dǎo)致的誤差，葉片的選定要根據(jù)實驗的具體目的來確定。為防止葉片移動造成蟲體脫落，可用斜放的塑膠板或聚酯板固定葉片^[31]。所用昆蟲應(yīng)選用行動力強(qiáng)的健康昆蟲，蟲齡的選用依據(jù)實驗?zāi)康膩泶_定，選用成蟲時一般選用剛剛羽化的，若蟲則選用剛完成蛻皮的。

4.2實驗昆蟲的預(yù)處理

進(jìn)行EPG的實驗前一般需要對選用的昆蟲進(jìn)行固定以方便昆蟲與金絲的粘連，目前常用的固定方法主要有負(fù)壓法、冷凍法或CO2麻醉法。負(fù)壓固定可采用真空泵或負(fù)壓等制作固定昆蟲的裝置，簡單的也可以利用水流產(chǎn)生的負(fù)壓。昆蟲的麻醉方法有干冰麻醉法、冷凍法和乙醚麻醉法。目前常用麻醉法與固定法相結(jié)合的方式固定昆蟲，其中麻醉法可選用CO2麻醉法，固定法采用真空泵負(fù)壓法。

4.3實驗昆蟲與金絲的連接

電極與昆蟲蟲體的連接是一個技術(shù)難點^[32]，即金絲表面比較光滑，橫截面較小，很難聚集銀膠，而試蟲的連接需要一定的接觸面積才能保證其牢固性。在實踐中，我們可以在金絲端部制作一個鉤狀結(jié)構(gòu)或者使之形成一個銀膠球的方式解決上述難點^[31]。將金絲端部浸入銀膠中，抽出后讓附著的銀膠在空氣中干燥 1～2 min，再將金絲端部浸入銀膠，如此反復(fù)至金絲端部形成一個銀膠球。銀膠球的大小可根據(jù)昆蟲個體大小進(jìn)行選擇。成蟲和大齡若蟲粘連時可先將麻醉過的綠盲蝽腹面用負(fù)壓裝置吸住，然后直接進(jìn)行粘連；低齡若蟲需要在解剖燈下進(jìn)行粘連的操作。

在將綠盲蝽與金絲粘連成功以后可直接與電極連接并開始記錄，但在分析數(shù)據(jù)時應(yīng)該把記錄開始到開始刺探前的這段時間去掉，因為先后連接金絲的昆蟲所受的干擾時間和程度不同，可能使得在記錄植物上的刺探開始前的適應(yīng)期不同。有學(xué)者認(rèn)為在連好金絲后需要先將昆蟲進(jìn)行饑餓或適應(yīng)處理。

4.4記錄過程中的問題

EPG 對外界干擾十分敏感，外界電波的干擾會影響記錄的信號，所以整個實驗裝置應(yīng)置于一個電壓比較穩(wěn)定、免除外界干擾的環(huán)境中，DC-EPG 必須使用接地的法拉第籠來屏蔽噪音^[33]。在每次實驗前，先要對 EPG 系統(tǒng)和放大系數(shù)進(jìn)行調(diào)校。植物電壓的調(diào)校不當(dāng)會造成只有正的波形或者只有負(fù)的波形被記錄的情況； 而放大系數(shù)的調(diào)校不當(dāng)會造成有些有意義的波形不能明確顯示^[34]。放大系數(shù)為 50 倍比較適宜。

EPG 實驗記錄時間的長短主要取決于實驗?zāi)康?。一般昆蟲與植物關(guān)系的研究需要記錄 6 h。而研究昆蟲傳毒機(jī)制，記錄幾分鐘就可以了。若研究寄主植物表面或葉肉層次物理化學(xué)性質(zhì)對昆蟲取食行為的影響，一般記錄30 min～3 h 。

另外需要在記錄時采用EPG通道隨機(jī)排列以及多重復(fù)的方法來盡可能的消除誤差。

5展望

盡管EPG技術(shù)經(jīng)過不斷的發(fā)展已經(jīng)比較成熟，但目前研究較為深入的主要是一些汁液取食類的刺吸式昆蟲如蚜蟲、粉虱等。對植食性盲蝽等細(xì)胞取食者的研究仍然不甚深入，現(xiàn)作出定義的一些盲蝽類昆蟲取食波形都是針對的一些較為籠統(tǒng)的行為意義；對盲蝽取食波形的劃分還不夠細(xì)致，且沒有經(jīng)過驗證；對一些不規(guī)范波形如突然超出量程的情況尚未發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)原因及其行為學(xué)意義，這還需要進(jìn)行更加細(xì)致的研究；同時在實驗過程當(dāng)中的一些操作技術(shù)需要進(jìn)一步的規(guī)范。鑒于近年來植食性盲蝽對果樹的危害日益嚴(yán)重，EPG技術(shù)用于果樹危害研究的可能性也需要進(jìn)行探究。

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