崔慧妮等

摘要：以NPT Ⅱ基因?yàn)楹Y選標(biāo)記，利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)將目的基因ZmHSD1轉(zhuǎn)入玉米自交系昌7-2、齊319和18-599的胚性愈傷組織，篩選抗性愈傷，并獲得再生植株。對(duì)再生植株基因組DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)表明，ZmHSD1基因已經(jīng)整合到玉米基因組中，并最終獲得轉(zhuǎn)基因T1代種子。

關(guān)鍵詞：玉米；農(nóng)桿菌；胚性愈傷組織；ZmHSD1基因

中圖分類(lèi)號(hào)：Q785文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2013）07-0006-03

糖皮質(zhì)激素是一類(lèi)動(dòng)物激素，參與糖、脂肪和蛋白質(zhì)的生物合成和代謝等過(guò)程，還具有抗炎的作用^[1]。11β-羥基類(lèi)固醇脫氫酶（11β-hydroxysteroid dehydrogenase， 11β-HSD）是調(diào)節(jié)糖皮質(zhì)激素的關(guān)鍵酶，它促進(jìn)活性糖皮質(zhì)激素與非活性激素之間的相互轉(zhuǎn)換^[2，3]。雖然目前在植物中還沒(méi)有鑒定出11β-HSD，但是隨著擬南芥基因組測(cè)序工作的完成，發(fā)現(xiàn)了八個(gè)類(lèi)似HSD的基因。最先鑒定出的是一種油菜籽HSD，它在利用ABA類(lèi)似物抑制種子萌發(fā)的過(guò)程中過(guò)量表達(dá)^[4]；Jolivet等^[5]證實(shí)在芝麻和油料作物中只存在微量的HSD，這些HSD編碼的蛋白表現(xiàn)出與NADP+所依賴的11β-HSD、17β-HSD/17β-類(lèi)固醇脫氫酶相同的性能^[6]。AtHSD1基因包括6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子，它編碼的蛋白由389個(gè)氨基酸組成，李鳳玲等^[7]將AtHSD1的cDNA連接到35S啟動(dòng)子后整合到擬南芥中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株明顯比野生株粗壯，其分支和長(zhǎng)角果的數(shù)量也明顯增多，轉(zhuǎn)AtHSD1基因植株的表型與過(guò)量產(chǎn)生BR或過(guò)量表達(dá)BR受體基因BRI1的表型一致^[8～10]；同時(shí)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的抗鹽性比野生植株高^[7]。因此，該基因在改善農(nóng)作物植株生長(zhǎng)、提高產(chǎn)量方面有很大的潛力。

本研究利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，嘗試將ZmHSD1基因轉(zhuǎn)入玉米自交系品種，以期獲得轉(zhuǎn)基因玉米植株，拓寬玉米種質(zhì)的遺傳背景，為高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)玉米品種的選育服務(wù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1植物材料玉米（Zea mays L.）自交系18-599、齊319和昌7-2。

1.1.2目的基因、載體、菌株ZmHSD1表達(dá)載體由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院基因工程實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。表達(dá)載體中，目的基因?yàn)閆mHSD1，其啟動(dòng)子為Ubi；篩選標(biāo)記基因?yàn)镹PTⅡ，其啟動(dòng)子為CaMV35S（圖1）。本研究所用質(zhì)粒為PZP211，大腸桿菌菌株為DH5α，農(nóng)桿菌菌株為L(zhǎng)BA4404。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1培養(yǎng)基在N6改良培養(yǎng)基^[11]的基礎(chǔ)上，添加0.25 mg/L Na2MnO3、0.025 mg/L CuSO4·5H2O和0.025 mg/L CoCl2·6H2O。

1.2.2幼胚愈傷組織受體系統(tǒng)參照孫慶泉等^[11]的方法，取幼胚接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，24～25℃暗培養(yǎng)，繼代，選擇誘Ⅱ型愈傷組織為轉(zhuǎn)化受體。

1.2.3農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化

①農(nóng)桿菌的培養(yǎng)與活化：將低溫保存的農(nóng)桿菌菌種LBA4404接種到添加25 mg/L Spe的YEB固體培養(yǎng)基平板上，挑取單菌落接種于含25 mg/L Spe的 YEB液體培養(yǎng)基中，置于搖床上預(yù)活化（28℃，200 r/min），取預(yù)活化的菌液培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期備用。

②愈傷組織浸染：浸染前將新培養(yǎng)的菌液離心沉淀菌體，用液體N6培養(yǎng)基重懸，并稀釋到所需OD值。將Ⅱ型愈傷組織分離成米粒大小的小塊，投放到稀釋好的菌液中浸染。用滅菌的濾紙吸干愈傷表面的菌液，并將其擺放到共培養(yǎng)培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)3 d，用頭孢水洗菌。將洗好的愈傷放到恢復(fù)培養(yǎng)基上恢復(fù)培養(yǎng)。

③抗性愈傷的篩選、分化和再生：恢復(fù)培養(yǎng)后的愈傷組織依次轉(zhuǎn)移到1次、2次、3次篩選培養(yǎng)基上，進(jìn)行抗性篩選，篩選劑為巴龍霉素。將篩選后存活的愈傷轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基上分化成苗。分化苗苗高4～5 cm時(shí)轉(zhuǎn)到生根壯苗培養(yǎng)基上。當(dāng)苗適度生根后轉(zhuǎn)到基質(zhì)（基質(zhì)∶蛭石=1∶1）中。成活植株轉(zhuǎn)到大田隔離區(qū)。

1.2.4轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè)CTAB法提取基因組DNA。對(duì)轉(zhuǎn)化植株、陽(yáng)性對(duì)照（質(zhì)粒）和陰性對(duì)照（未轉(zhuǎn)化植株）進(jìn)行PCR檢測(cè)，檢測(cè)對(duì)象為目的基因ZmHSD1和標(biāo)記基因NPTⅡ。根據(jù)已知的ZmHSD1基因序列，利用primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)ZmHSD1的引物，上游引物在啟動(dòng)子內(nèi)部，下游引物在編碼區(qū)內(nèi)，S： CACGATTCTTCCTCGGCTCCTCT， A： TGCTACTCCTTCCTTTCCTGGCT；標(biāo)記基因NPTⅡ的引物為S： GTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTG，A： AGCTCTTCAGCAATATCACGGGTAGC。引物由上海生工生物工程公司合成。用25 μl PCR反應(yīng)體系。擴(kuò)增反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，59℃退火50 s，72℃延伸50 s，35 個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10 min；4℃保存。1%瓊脂糖凝膠、1%TBE電泳緩沖液電泳，溴化乙錠染色，紫外分析，拍照。

2結(jié)果與分析

2.1轉(zhuǎn)基因植株的獲得

將玉米幼胚（授粉后10～15 d）接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)出胚性愈傷組織（圖2-1，2-2，2-3）；將經(jīng)農(nóng)桿菌浸染后的愈傷（圖2-4），恢復(fù)培養(yǎng)1周，愈傷組織生長(zhǎng)狀態(tài)有所改善，轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基篩選，1輪后有些愈傷開(kāi)始變褐，3輪后大部分未轉(zhuǎn)化愈傷褐化死亡，愈傷組織上出現(xiàn)的小塊鮮活愈傷組織突起基本上為抗性愈傷，抗性愈傷在篩選培養(yǎng)基上生長(zhǎng)正常 （圖2-5）；將經(jīng)過(guò)3輪篩選的愈傷轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基上光照培養(yǎng)，25 d后愈傷表面開(kāi)始出現(xiàn)綠色芽點(diǎn)，之后綠色芽點(diǎn)逐漸分化成巴龍抗性苗（圖2-6）；將幼苗轉(zhuǎn)到生根壯苗培養(yǎng)基上（圖2-7），使苗生根，期間有少量白化苗出現(xiàn)；待苗長(zhǎng)出2～3條根、高約10～15 cm時(shí)，打開(kāi)封口膜，煉苗5 d后移栽花盆 （圖2-8）；3周后移栽轉(zhuǎn)基因隔離區(qū)，開(kāi)花期進(jìn)行人工自交結(jié)實(shí)（圖2-9）；最終獲得轉(zhuǎn)基因種子（圖2-10）。

2.2轉(zhuǎn)基因植株分子檢測(cè)

2.2.1目的基因ZmHSD1的PCR檢測(cè)利用ZmHSD1引物對(duì)抗性苗基因組DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)，有33株抗性苗出現(xiàn)與陽(yáng)性對(duì)照一致的444 bp的特異性擴(kuò)增條帶（圖3），表明該33株轉(zhuǎn)基因植株已將外源基因整合到基因組中。

2.2.2標(biāo)記基因NPT Ⅱ的PCR檢測(cè)對(duì)已知陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA進(jìn)行標(biāo)記基因NPT Ⅱ的PCR擴(kuò)增，均得到與陽(yáng)性對(duì)照一致的650 bp的特異性擴(kuò)增條帶（圖4），表明目的基因PCR檢測(cè)的陽(yáng)性株也全為標(biāo)記基因陽(yáng)性株。對(duì)標(biāo)記基因的檢測(cè)可以排除玉米基因組中ZmHSD1基因的干擾。

3結(jié)論

3個(gè)供試玉米自交系18-599、齊319和昌7-2的幼胚都能誘導(dǎo)產(chǎn)生Ⅱ型愈傷組織，其中18-599所獲愈傷組織質(zhì)量好、數(shù)量多，適于大量轉(zhuǎn)化；齊319和昌7-2愈傷顆粒松散、質(zhì)量不高，尤其是昌7-2，胚性愈傷數(shù)量較少。

經(jīng)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化共得到899株轉(zhuǎn)化株，通過(guò)PCR檢測(cè)初步證明有33株為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化植株，其中18-599有686株轉(zhuǎn)化株，陽(yáng)性株21株，轉(zhuǎn)化效率為3.06%；齊319有183株轉(zhuǎn)化株，陽(yáng)性株10株，轉(zhuǎn)化率為5.46%；昌7-2有30株轉(zhuǎn)化株，陽(yáng)性株2株，轉(zhuǎn)化率為6.67%。

最終獲得ZmHSD1轉(zhuǎn)基因玉米T1代種子，為玉米優(yōu)良品種的選育奠定了基礎(chǔ)。

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