郭晶晶 丁選勝

【摘要】目的研究葛根素-7-O-葡萄糖苷的氧化性溶血作用。方法制備5%家兔紅細胞懸液，與不同濃度供試藥液共孵育，用AAPH誘導氧化溶血，檢測藥物的抗氧化性溶血作用。結果在低濃度范圍（0.4～3mg/mL）內(nèi)，藥物顯示出抗氧化性作用，而當濃度>3mg/mL后，藥物的抗氧化性作用隨濃度的增大而減小。結論臨床使用該藥時應控制在低濃度，增大濃度后藥物的抗氧化性逐漸減弱。

【關鍵詞】葛根素-7-O-葡萄糖苷；抗氧化；紅細胞

【中圖分類號】R961 【文獻標識碼】A【文章編號】1004-4949（2013）07-59-02

葛根為豆科植物野葛或甘葛藤的根，在我國藥用歷史悠久[1]，其中葛根素是葛根特有的也是主要的有效成分。1993年葛根素被衛(wèi)生部批準用于臨床。臨床多使用葛根素注射液，用于心血管疾病的治療。葛根素具有擴張冠狀動脈，降血糖，降血脂，抗動脈粥樣硬化，消除自由基和抗脂質(zhì)過氧化等多種作用[2，3，4]。

葛根素化學名為4′，7-二羥基-8-β-D-葡萄糖基異黃酮，臨床使用的葛根素多為注射劑，但是因葛根素水溶性差，臨床需加入50%丙二醇助溶，高濃度的丙二醇易引起不良反應，因此，越來越多的研究專注于對葛根素進行結構修飾以改善其水溶性。葛根素糖基化修飾是一種有效的方法[5]，在7位加入一個葡萄糖基可以明顯改善水溶性。報道指出葛根素-7-O-葡萄糖苷的水溶性較葛根素增加了18倍[5]。但是對于葛根素-7-O-葡萄糖苷的抗氧化性質(zhì)未見報道。葛根素為異黃酮類物質(zhì)，具有很好的抗氧化性質(zhì)，這也是構成其藥理作用的基礎之一。因此本文著重研究葛根素-7-O-葡萄糖苷的抗氧化作用。

本實驗中使用紅細胞的體外氧化溶血模型，因為紅細胞膜富含不飽和脂肪酸，易受自由基的氧化攻擊，最終導致紅細胞溶血[6，7]。實驗采用水溶性自由基產(chǎn)生體系2，2-偶氮（2-甲基丙基脒）二鹽酸鹽（AAPH）誘導氧化性溶血。AAPH是常用的氧化物質(zhì)，因為其性質(zhì)穩(wěn)定，水溶性好[8]。

1材料

1.1受試藥物：葛根-7-O-葡萄糖苷單體，南京師范大學袁生教授提供，純度98%。

1.2實驗動物： 家兔6只，體重1.8-2.2kg，雌雄各半，南京青龍山動物繁殖所提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（蘇）2012-0008。

1.3試劑及儀器：

氯化鈉注射液，購自江蘇亞邦生緣藥業(yè)有限公司，批號：12051203；蒸餾水；2，2-偶氮（2-甲基丙基脒）二鹽酸鹽（AAPH），購自上海百靈威科技有限公司，CAS號：2997-92-4。80-2離心沉淀劑，江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠；HH-S型恒溫水浴鍋，鞏義市英峪予華儀器廠；752N紫外可見分光光度計，上海精密科學儀器有限公司；BS124S分析天平，Sartorius。

2方法

2.1 50mg/mL葛根素-7-O-葡萄糖苷溶液的配制： 精密稱取藥物1.25g置于25mL容量瓶中，用氯化鈉注射液定容。

2.2 5%家兔紅細胞懸液的配制： 取兔血10mL，玻璃棒攪動去纖維。將血液于離心機中1500r/min離心15分鐘，除去上層血漿。沉淀的紅細胞再用氯化鈉注射液洗滌2-3次，至上清液不顯紅色為止。將所得紅細胞用氯化鈉注射液配成5%的紅細胞懸液。

2.3 AAPH誘導氧化性溶血實驗 ： 取潔凈試管11支，編號1～11號，其中1～9號試管為不同濃度藥液管，10號、11號分別為陰陽性管，按表1進行加樣，并向供試管各加入250mmol/L的AAPH溶液1.40mL，使供試管藥物的終濃度分別為0.4、0.8、1.2、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0mg/mL，同時所有供試管AAPH的終濃度都為70mmol/L，所有試管于37℃水浴孵育3h。孵育完成后，1500r/min離心15min，吸取上清液于紫外可見分光光度計540nm處測定吸光度（A值）。按下式計算各管溶血率：溶血率（%）=[（樣品管A值-空白對照管A值）/（陽性對照管A值-空白對照管A值）]×100%。計算平均溶血率，結果見圖1。

3結果

實驗結果表明，AAPH可以誘導紅細胞的氧化損傷，使紅細胞膜破裂而產(chǎn)生溶血。從圖1可以看出，在低劑量范圍內(nèi)（0.4～3mg/mL），隨著藥物濃度的增加，溶血率逐漸減小。在高劑量范圍內(nèi)（3～12mg/mL），溶血率隨藥物濃度的增加而逐漸增大。

圖1AAPH誘導紅細胞氧化性溶血曲線

4討論

本實驗中產(chǎn)用了AAPH氧化體系來研究葛根素-7-O-葡萄糖苷的抗氧化性質(zhì)。紅細胞膜富含多不飽和脂肪酸，對氧化損傷敏感，是研究氧化損傷作用的良好模型。AAPH屬于水溶性偶氮引發(fā)劑，通過均裂產(chǎn)生陽離子自由基，該自由基與O2快速反應生成過氧化自由基，進而氧化損傷紅細胞膜導致溶血。實驗結果表明，在低濃度范圍內(nèi)（0.4～3mg/mL），藥物呈現(xiàn)出很好的劑量依賴性的抗氧化作用。當藥物濃度超過3mg/mL，其抗AAPH氧化損傷的能力隨著濃度的增大而減弱，甚至表現(xiàn)出一定的致溶血作用。提示臨床在使用葛根素-7-O-葡萄糖苷時應控制在低劑量范圍，因為高劑量下藥物的抗氧化性減弱。

參考文獻

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[2]亢小迪.葛根素治療不穩(wěn)定型心絞痛的療效及發(fā)熱不良反應防治[J].時珍國醫(yī)國藥 2008， 19（6）：1469-1470.

[3]謝瑞芹，都軍，郝玉明等. 葛根素注射液對冠心病患者缺血再灌注心肌保護作用及機制[J]. 中國中西醫(yī)結合雜志 2003，23（12）：895-897.

[4]Xuan Bo， Zhou Yue-hua， Yang Rua-lin， et al. Improvement of ocular blood flow and retinal functions with puerarin analogs[J]. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics 1999，15（3）： 207-216.

[5]Jiang Jie-rong， Sheng Yuan， Ding Juan-fang， et al. Conversion of puerarin into its 7-O-glycoside derivatives by Microbacterium oxydans （CGMCC 1788） to improve its water solubility and pharmacokinetic properties[J]. Applied Microbiology and Biotechnology 2008， 81：647-657.

[6]Arnab Banerjee， A. Kunwar， B. Mishra， et al. Concentration dependent antioxidant/pro-oxidant activity of curcumin. Studies from AAPH induced hemolyssi of RBCs[J]. Chemico-Biological Interactions 2008， 174：134-139.

[7]Ana S. Magalhaes， Branca M. Silva， Jose A. Peraira， et al. Protective effect of quince（Cydonia oblonga Miller） fruit against oxidative hemolysis of human erythrocytes[J]. Food and chemical Toxicology 2009， 47：1372-1377.

[8]C.S. Shiva Shankar Reddy， M.V.V. Subramanyam， R.Vani， et al. In vito models of oxidative stress in rat erythrocytes： Effect of antioxidant supplements[J]. Toxicology in vitro 2007， 21：1355-1364.