陳潔君　吉恒東　郭士成等

【摘 要】目的：探討中國漢族人群中HLA-DQAl基因拷貝數(shù)目多態(tài)性與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病風(fēng)險的關(guān)系。方法：采用比較基因組雜交和AccuCopy檢測技術(shù)，檢測138例類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者和191例正常對照者的HLA-DQAl基因拷貝數(shù)目。采用Logistic回歸模型分析各基因型患者類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病風(fēng)險。結(jié)果：HLA-DQAl基因拷貝數(shù)目增加的個體，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病風(fēng)險顯著升高（p = 0.009）。結(jié)論：HLA-DQAl基因拷貝數(shù)目多態(tài)是RA的遺傳易感因素，HLA-DQAl基因拷貝數(shù)目增加則是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的危險因素。

【關(guān)鍵詞】 關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕；HLA-DQAl；拷貝數(shù)目多態(tài)性；易感性；中國漢族人

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥為主的自身免疫性疾病，其病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，遺傳和環(huán)境都有可能導(dǎo)致此疾病的發(fā)生與發(fā)展。RA作為一種具有遺傳傾向的多基因疾病，不同種族、不同地區(qū)乃至不同個體之間遺傳特征均有不同程度的變異。

拷貝數(shù)目變異（copy number variation ，CNV）是近年來新發(fā)現(xiàn)的一類基因組結(jié)構(gòu)變異，包括基因組節(jié)段的缺失、重復(fù)及復(fù)雜重排等，是疾病發(fā)生的重要遺傳學(xué)基礎(chǔ)。CNV的基因組節(jié)段占整個人類基因組的12%，覆蓋人類基因組中13%的基因及5%以上的編碼序列[1]。拷貝數(shù)目多態(tài)性（copy number polymorphisms，CNP）是CNV的一種，是在人群中分布頻率 > 1%的CNV。到目前為止，CNV/CNP在RA發(fā)病中的機(jī)制雖不太明確，但已有少量報道。如趨化性細(xì)胞因子配體蛋白CCL3L1 （chemokine ligand 3-like-1，CCL3L1）[2-3]、Fcγ受體3B（Fc gamma receptor 3B，F(xiàn)CGR3B）[4-5]和

B淋巴細(xì)胞前體1（pre-B lymphocyte1，VPREB1）[6]、

晚期角質(zhì)化包膜蛋白基因LCE （late cornified envelope，LCE）[7-10]和RA的易感性有關(guān)。

人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）

是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，參與抗原處理和免疫調(diào)節(jié)等過程。有研究表明，HLA基因拷貝數(shù)目多態(tài)性與RA發(fā)病有關(guān)[11]。HLA-DQA1基因是HLA抗原系統(tǒng)的成員，存在拷貝數(shù)目多態(tài)性[12]，但未見HLA-DQA1基因拷貝數(shù)目變異與RA的相關(guān)報道。本研究采用病例對照研究，探討HLA-DQA1基因拷貝數(shù)目變異與RA易感性的關(guān)系。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選取2008年至2010年在江蘇省泰州市人民醫(yī)院住院及門診確診的RA漢族患者138例，定為病例組。男30例，女108例；年齡18～75歲，平均（53.36±13.74）歲；病程最短5個月，最長15年，中位數(shù)3.23年。選取江蘇省泰州市健康者191例，均為漢族，定為對照組。男111例，女 80例；年齡18～60歲，平均（46.99±5.21）歲。本研究經(jīng)復(fù)旦大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，流行病調(diào)查資料收集及血液樣本采集均經(jīng)研究對象知情同意，遵守倫理學(xué)的各項(xiàng)規(guī)定。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) ①病例組診斷均符合1987年美國風(fēng)濕病學(xué)會（ACR）關(guān)于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②年齡18～75歲；③愿意并簽署知情同意書。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) ①患胃及十二指腸潰瘍或慢性胃炎者；②合并心、肝、腎和造血系統(tǒng)嚴(yán)重疾病者。

2 方 法

2.1 微陣列比較基因組雜交（aCGH）定位 CNVs

區(qū)域外周血基因組DNA抽提采用DNA抽提純化試劑盒（Qiagen公司生產(chǎn)）。全基因組DNA水平上的CNVs檢測采用Agilent 1M （Agilent公司生產(chǎn)）aCGH芯片技術(shù)平臺，該平臺包含約100萬個寡核苷酸探針，DNA編碼區(qū)和非編碼區(qū)分辨率均高達(dá)3 Kb。染色體片段和基因定位依據(jù)UCSC公共數(shù)據(jù)庫[UCSC Genome Browser on Human Feb. 2009 （GRCh37/hg19）Assembly]。分別采用Agilent G444GA和Feature

Extraction9.5（Agilent公司）進(jìn)行微陣列掃描和數(shù)據(jù)提取。

2.2 單點(diǎn)CNV的檢測與驗(yàn)證 通過aCGH定位的CNV區(qū)域，使用AccuCopy檢測技術(shù)[13]（一種多重競爭性PCR技術(shù)，上海天昊生物技術(shù)有限公司）在病例組和對照組樣本中進(jìn)行檢測。取一定量的競爭DNA（I）片段混合物——每個片段與各自對應(yīng)的基因片段僅有微小差別（通常為2～5個

堿基長度差異），與合適量的樣本DNA（S）混合，作為隨后多重?zé)晒飧偁幮訮CR擴(kuò)增的模板；多重PCR產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管電泳后對不同基因位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物以及同一位點(diǎn)的不同模板（樣本DNA與競爭DNA）擴(kuò)增產(chǎn)物根據(jù)其長度差異進(jìn)行分離；分析每個基因片段的S/I值，利用參照基因S/I值對目標(biāo)基因S/I值進(jìn)行校正后獲取目標(biāo)基因的準(zhǔn)確拷貝數(shù)目。取拷貝數(shù)目為2、大于2，及小于2的樣本各3個，對上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，以避免引物序列多態(tài)性引起的拷貝數(shù)目檢測的偏移。

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用擬合優(yōu)度檢驗(yàn)檢測每個位點(diǎn)基因型頻率的分布是否符合Hardy-Weinberg遺傳平衡。采用Logistic 回歸對年齡、性別進(jìn)行校正后分析HLA-DQA1與RA易感性的相關(guān)性關(guān)系，并以比值比（Odds Ratio， OR）及其95%可信區(qū)間（CI）表示相對風(fēng)險度?？截悢?shù)目缺失和增加的閾值分別為低于0.8和高于1.2，所用樣本檢驗(yàn)2次。檢驗(yàn)水準(zhǔn) α= 0.05。

3 結(jié) 果

3.1 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn) HLA-DQA1

CNV在對照組進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，結(jié)果為χ2= 161.1，P = 0.93，說明對照組符合Hardy-Weinberg平衡。

3.2 比較基因組雜交（aCGH）定位HLA-DQA1的CNV區(qū)域 通過微陣列aCGH方法，進(jìn)行了10例健康對照組樣本的檢測。連續(xù)5個探針的一致性信號（重復(fù)或缺失）可代表一個CNV，中國漢族人群中存在HLA-DQA1的拷貝數(shù)目變異，位于6號染色體（6p21.3）32608277-32620568 Kb之間，見圖1（每個點(diǎn)代表1個探針。綠點(diǎn)表示拷貝數(shù)目缺失）。

3.3 HLA-DQA1基因拷貝數(shù)目與RA易感性的相關(guān)性 針對上述CNV涉及探針，利用AccuCopy檢測技術(shù)對138例病例組患者及191例對照組健康對照者進(jìn)行了拷貝數(shù)目檢測，發(fā)現(xiàn)存在拷貝數(shù)目為2、大于2及小于2三種情況。對挑選的3種拷貝數(shù)目個體進(jìn)行Sanger測序后，其拷貝數(shù)目與AccuCopy的結(jié)果一致。 運(yùn)用Logistic回歸校正性別與年齡，發(fā)現(xiàn)HLA-DQA1基因拷貝數(shù)目與RA具有強(qiáng)相關(guān)性 （p = 0.009），見表1。

HLA-DQA1基因拷貝數(shù)目減少和正?？截悢?shù)目都可以降低RA的發(fā)病風(fēng)險，而HLA-DQA1基因拷貝數(shù)目增加則是RA的危險因素。

4 討 論

HLA抗原是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，參與抗原處理、免疫調(diào)節(jié)等多種過程。HLA-Ⅱ類分子是由α鏈和β鏈組成的異二聚體糖蛋白分子，DQ 抗原的α鏈和β鏈分別由6號染色體的 DQA1 和 DQB1 基因編碼。DQA1 和 DQB1 等位基因均具有高度的多態(tài)性，不同的等位基因產(chǎn)物具有不同的氨基酸組成和空間構(gòu)象，某些 HLA-DQB1、HLA-DQA1 等位基因編碼的產(chǎn)物可能有助于選擇性地提呈與疾病相關(guān)的自身抗原肽，從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。很多學(xué)者認(rèn)為，某些 HLA 等位基因通過影響患者自身抗體的產(chǎn)生在自身免疫性疾病的發(fā)生和預(yù)后中起重要作用[14-15]。

研究表明，HLA-DQA1基因多態(tài)性與多種疾病的發(fā)病風(fēng)險相關(guān)。英國Leish GEN等[16]團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，HLA-DRB1-HLA-DQA1與印度和巴西的內(nèi)臟利什曼病易感性相關(guān)；馬來西亞的研究者發(fā)現(xiàn)， HLA-DRB1/HLA-DQA1 rs9271366 中的等位基因G 和純合子GG 顯著增加馬來西亞人系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）的易感性（OR > 1， p < 0.05），而HLA-DQB1/HLA-DQA2 rs9275328中的 T等位基因和基因型 CT 則對馬來西亞人和中國人患SLE起保護(hù)作用[17]；Murray JA等[18]研究發(fā)現(xiàn)，97%的乳糜瀉患者攜帶DQA1*05 和DQB1* 02基因；梁敏等[19]發(fā)現(xiàn)，廣西漢族2型糖尿病及其并發(fā)癥與HLA有關(guān)聯(lián)，HLA-DQA1*0401可能為2型糖尿病的保護(hù)基因，HLA-DQA1*0104可能為2型糖尿病的易感基因，HLA-DQA1*0501對2型糖尿病合并腎病、高血壓具有保護(hù)作用；張雄鷹等[20]發(fā)現(xiàn)，HLA-DQA1*0501 和 HLA-DQB1*0201等位基因可能是山西漢族干燥綜合征的易感基因，而 HLA-DQA1*0301/2 等位基因可能是其保護(hù)基因。

拷貝數(shù)目的變化可影響基因的劑量，因此，HLA-DQA1 基因的拷貝數(shù)目多態(tài)性也可能導(dǎo)致HLA-DQA1抗原表達(dá)改變，進(jìn)而影響疾病的發(fā)生發(fā)展。黃理明等[12]在研究中國人群中HLA-DQA1基因拷貝數(shù)目多態(tài)性與胃癌發(fā)病風(fēng)險的關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，攜帶HLA-DQA1 基因2拷貝基因型的患者，胃癌發(fā)病風(fēng)險顯著升高（OR=1.87，95%CI為1.15～3.06，P = 0.01）。我們的研究結(jié)果表明，HLA-DQA1基因拷貝數(shù)目與RA具有強(qiáng)相關(guān)性

（p = 0.009），HLA-DQA1基因拷貝數(shù)目減少和正?？截悢?shù)目都可以降低RA的發(fā)病機(jī)率，而HLA-DQA1基因拷貝數(shù)目增加則是RA發(fā)病的危險因素。

HLA-DQA1基因拷貝數(shù)目多態(tài)性是RA的遺傳易感因素，其具體的關(guān)聯(lián)格局尚有待進(jìn)一步進(jìn)行功能研究來確定。

5 參考文獻(xiàn)

[1] Craddock N， Hurles ME， Cardin N， et al. Genome-wide association study of CNVs in 16，000 cases of eight common diseases and 3，000 shared controls[J].Nature，2010，464（7289）：713-720.

[2] Townson JR， Barcellos LF， Nibbs RJ. Gene copy number regulates the production of the human chemokine CCL3-L1[J]. Eur J Immunol，2002，32（10）：3016-3026.

[3] Carpenter D， Walker S， Prescott N， et al. Accuracy and differential bias in copy number measurement of CCL3L1 in association studies with three auto-immune disorders[J].BMC Genomics，2011，12（10）：418-426.

[4] McKinney C，Merriman TR. Meta-analysis confirms a role for deletion in FCGR3B in autoimmune phenotypes[J]. Hum Mol Genet，2012，21（10）：2370-2376.

[5] McKinney C，F(xiàn)anciulli M，Merriman ME，et al.Association of variation in Fcgamma receptor 3B gene copy number with rheumatoid arthritis in Caucasian samples[J].Ann Rheum Dis，2010，69（9）：1711-1716.

[6] Yim SH， Chung YJ， Jin EH， et al. The potential role of VPREB1 gene copy number variation in susceptibility to rheumatoid arthritis[J].Mol Immunol，2011，48（11）：1338-1343.

[7] Zhang XJ， Huang W， Yang S， et al. Psoriasis genome-wide association study identifies susceptibility variants within LCE gene cluster at 1q21[J].Nat Genet，2009，41（2）：205-210.

[8] Huffmeier U， Bergboer JG， Becker T， et al.Replication of LCE3C-LCE3B CNV as a risk factor for psoriasis and analysis of interaction with other genetic risk factors[J].J Invest Dermatol，2010，130（4）：979-984.

[9] Lu XL， Guo JP， Zhou XJ，et al.Deletion of LCE3C_LCE3B is associated with rheumatoid arthritis and systemic lupus erythematosus in the Chinese Han population[J]. Ann Rheum Dis，2011，70（9）：1648-1651.

[10] Docampo E， Rabionet R， Riveira-Munoz E， et al.Deletion of the late cornified envelope genes， LCE3C and LCE3B， is associated with rheumatoid arthritis[J].Arthritis Rheum，2010，62（5）：1246-1251.

[11] Jiang DK， Sun JL， Cao GW， et al. Genetic variants in STAT4 and HLA-DQ genes confer risk of hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma[J].Nat Genet，2013，45（1）：72-75.

[12] 黃理明，程炎，于典科，等.HLA-DQAl基因拷貝數(shù)目多態(tài)與胃癌發(fā)病風(fēng)險的關(guān)系[J].中華腫瘤雜志，2012，34（4）：269-271.

[13] Du RQ， Lu CC， Jiang ZW， et al. Efficient typing of copy number variations in a segmental duplication-mediated rearrangement hotspot using multiplex competitive amplification[J].J Hum Genet，2012，57（8）：545-551.

[14] Mikuls TR， Thiele GM， Deane KD，et al. Porphyromonas gingivalis and disease-related autoantibodies in individuals at increased risk of rheumatoid arthritis[J]. Arthritis Rheum， 2012，64（11）：3522-3530.

[15] Duquesnoy RJ.The antibody response to an HLA mismatch： a model for nonself-self discrimination in relation to HLA epitope immunogenicity[J]. Int J Immunogenet， 2012，39（1）：1 - 9.

[16] Fakiola M ，Strange A，Cordell HJ，et al. Common variants in the HLA-DRB1-HLA-DQA1 HLA class II region are associated with susceptibility to visceral leishmaniasis[J].Nat Genet，2013，45（2）：208-213.

[17] Chai HC， Phipps ME， Othman I，et al.HLA variants rs9271366 and rs9275328 are associated with systemic lupus erythematosus susceptibility in Malays and Chinese[J].Lupus，2013，22（2）：198-204.

[18] Murray JA，Moore SB，Van Dyke CT，et al.HLA DQ gene dosage and risk and severity of celiac disease[J].Clin Gastroenterol Hepatol，2007，5（12）：1406-1412.

[19] 梁敏，羅佐杰，冼蘇，等.HLA-DQA1基因與廣西地區(qū)2型糖尿病關(guān)聯(lián)性的研究[J].廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2000，17（6）：972-974.

[20] 張雄鷹，宋秀珍，秦雄偉，等.山西漢族原發(fā)性干燥綜合征與 HLA-DQ基因多態(tài)性相關(guān)性的研究[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2011，27（2）：182-185.