程霞英 楊宗岐

摘 要： 為快速誘導(dǎo)形成適合懸浮培養(yǎng)的半夏愈傷組織，對(duì)半夏愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基采取了優(yōu)化組合。在MS+1.0 mg·L-16-BA+2.0 mg·L-1 NAA培養(yǎng)基上能誘導(dǎo)形成濃綠、致密的愈傷組織；在MS+0.5 mg·L-1 6-BA+2.0 mg·L-1 2，4-D的培養(yǎng)基上，可誘導(dǎo)形成疏松的黃白色愈傷組織，但生長(zhǎng)緩慢。將前者后期繼代培養(yǎng)基配方調(diào)整為MS+0.5 mg·L-16-BA+2.0 mg·L-1 2，4-D，可較快誘導(dǎo)出疏松的黃白色愈傷組織，適合做懸浮培養(yǎng)。

關(guān)鍵詞：半夏；愈傷組織；誘導(dǎo)；培養(yǎng)基

中圖分類號(hào)：S567.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.09.002

Optimization Study of Callus Induction on Pinellia ternata

CHENG Xia-ying， YANG Zong-qi

（College of Life Sciences，Zhejiang Sci-Tech University，Hangzhou，Zhejiang 310018，China）

Abstract： In order to quickly induce callus of Pinellia ternata Breit suitable for suspension culture， the optimum combination of medium was taken.The dark green and dense callus were induced on MS+1.0 mg·L-1 6-BA+2.0 mg·L-1 NAA；and yellow and white callus were induced on MS+0.5 mg·L-1 6-BA+2.0 mg·L-1 2，4-D，but the callus grew slowly.Suitable callus could be got when the medium in the late of the former were adjusted for MS+0.5 mg·L-1 6-BA+2.0 mg·L-1 2，4-D，and could be suspended in liquid medium after 3～5 times of subculture.

Key words： Pinellia ternata；callus；induction；cultivation medium

三葉半夏Pinellia ternata（Thunb.）Breit.（又名半夏）為天南星科Araceae半夏屬Pinellia多年生小草本，株高15～30 cm，塊莖近球形，葉出自塊莖頂端，葉柄長(zhǎng)6～23 cm，主產(chǎn)四川、湖北、河南、貴州、安徽等地。半夏是一種重要的藥用植物，其塊莖可入藥[1-2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在558種中藥處方中，半夏的使用頻率處第22位。半夏性溫，味辛，有毒，傳統(tǒng)藥理作用為燥濕化痰，降逆止嘔，消痞散結(jié)，主要用于痰多咳喘，頭痛眩暈，嘔吐反胃，梅核氣癥等。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，半夏還具有抗腫瘤、抗生育、降血脂、護(hù)肝和治療冠心病等多種重要的作用[3]。本試驗(yàn)對(duì)半夏愈傷組織的誘導(dǎo)進(jìn)行進(jìn)一步探究，通過調(diào)整繼代過程中培養(yǎng)基配方，優(yōu)化培養(yǎng)方案，提高了適合懸浮培養(yǎng)的愈傷組織培養(yǎng)效率，為半夏懸浮培養(yǎng)藥物產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

半夏塊莖采自河北省易縣（三葉半夏）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體的獲得及處理 選取直徑為1.0 cm左右的的塊莖用清水洗凈，在溫度為28 ℃、相對(duì)濕度為80%條件下用濕沙催芽，待葉片長(zhǎng)至3～4 cm時(shí)，取葉片及葉柄用0.1%升汞滅菌15 min，無(wú)菌水沖洗5次。葉片和葉炳分別切片和切段接種在不同激素配比的培養(yǎng)基上，放置于25 ℃、光照1 500 lx，10～12 h·d-1條件下進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2 誘導(dǎo)半夏愈傷組織的培養(yǎng)基設(shè)計(jì)方案 在MS培養(yǎng)基中添加不同激素濃度及組合（包括6-BA、2，4-D和6-BA、NAA），制成不同濃度梯度的激素培養(yǎng)基配方，如表1和表2所示。

1.2.3 愈傷繼代[4-5] 選取生長(zhǎng)狀況良好的愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)，每15 d繼代一次。

1.2.4 半夏愈傷組織繼代過程中培養(yǎng)基的調(diào)整 用以上2種激素組合的MS培養(yǎng)基進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)，并經(jīng)過2次繼代后觀察發(fā)現(xiàn)，用6-BA、2，4-D誘導(dǎo)的愈傷組織疏松、黃白色，但生長(zhǎng)緩慢，且死亡率相對(duì)較高；用6-BA、NAA誘導(dǎo)的愈傷組織生長(zhǎng)快，幾乎無(wú)死亡現(xiàn)象，但是愈傷組織堅(jiān)實(shí)，呈綠色，易形成叢生芽。將部分用6-BA、NAA誘導(dǎo)的愈傷組織經(jīng)2次繼代后，轉(zhuǎn)到6-BA、2，4-D激素的培養(yǎng)基上（選擇對(duì)愈傷誘導(dǎo)最佳的6-BA和2，4-D激素組合配方）繼代，觀察記錄試驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同外植體形成愈傷組織的差別

將半夏外植體葉片和葉柄分別接入上述培養(yǎng)基中培養(yǎng)，2周后葉柄開始膨大，形成明顯的愈傷組織，但葉片變化不明顯。1個(gè)月后葉片和葉柄均可形成明顯的愈傷組織，其結(jié)果如表3所示。

由表3可以看出，在15 d內(nèi)用葉柄誘導(dǎo)愈傷組織比葉片誘導(dǎo)率高，而且愈傷組織生長(zhǎng)快。30 d后，誘導(dǎo)率差別變得不太明顯，但愈傷組織生長(zhǎng)量差別明顯。這說明雖然用葉片和葉柄均能誘導(dǎo)出愈傷組織，但葉柄更適合用作誘導(dǎo)愈傷組織的外植體。

2.2 不同激素組合對(duì)誘導(dǎo)半夏形成愈傷組織的影響

用6-BA、NAA和6-BA、2，4-D兩種激素組合對(duì)半夏進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)，接種1月后觀察生長(zhǎng)變化（圖1、圖2）。

由表4和表5可以看出，使用NAA誘導(dǎo)愈傷的最適激素濃度為MS+1.0 mg·L-1 6-BA+2.0 mg·L-1NAA，愈傷誘導(dǎo)率高達(dá)93.6%；使用2，4-D誘導(dǎo)愈傷的最適激素濃度為MS+0.5 mg·L-1 6-BA+2.0 mg·L-1 2，4-D，愈傷誘導(dǎo)率高達(dá)92.5%。使用兩種組合1個(gè)月后，對(duì)半夏愈傷組織誘導(dǎo)率的影響不大，但是愈傷形態(tài)差別較大。使用6-BA、2，4-D誘導(dǎo)出的愈傷組織松軟，呈黃白色，但生長(zhǎng)量極??；而使用6-BA、NAA得到的愈傷組織則相對(duì)堅(jiān)實(shí)，多呈綠色，且生長(zhǎng)量大。

2.3 調(diào)整繼代培養(yǎng)基后的效果

在分別使用6-BA、NAA及6-BA、2，4-D對(duì)半夏愈傷組織進(jìn)行2次繼代培養(yǎng)（1個(gè)月）后發(fā)現(xiàn)，使用NAA誘導(dǎo)的愈傷組織依然呈綠色，而且很堅(jiān)實(shí)；而使用2，4-D誘導(dǎo)的愈傷組織生長(zhǎng)很慢。將部分用MS+1.0 mg·L-1 6-BA+2.0 mg·L-1NAA誘導(dǎo)的愈傷組織，在用相同培養(yǎng)基繼代2次后，改用MS+0.5 mg·L-1 6-BA+2.0 mg·L-1 2，4-D繼代，繼代培養(yǎng)2～3次后愈傷組織形態(tài)改變很大，顏色由綠色變?yōu)榘咨螯S白色，變得很疏松（圖3）。

由表6看出，雖然調(diào)整培養(yǎng)基后，生長(zhǎng)速率有所減緩，但愈傷變得疏松，成黃白色，且死亡率并沒有增加，所以綜合比較來(lái)看，進(jìn)行優(yōu)化處理后的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)方法效率更高，可為半夏懸浮培養(yǎng)藥物產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

3 結(jié) 論

在半夏愈傷組織誘導(dǎo)過程中，葉柄比葉片更適合用作誘導(dǎo)愈傷組織的外植體；使用6-BA、NAA及6-BA、2，4-D組合均可得到結(jié)果。使用NAA誘導(dǎo)得到的愈傷組織濃綠、堅(jiān)實(shí)，更易形成叢生芽；使用2，4-D得到的愈傷組織多呈黃白色、疏松，適合作懸浮培養(yǎng)，但愈傷生長(zhǎng)緩慢，且死亡率相對(duì)較高。在經(jīng)過2次繼代培養(yǎng)后調(diào)整繼代培養(yǎng)基，通過對(duì)比表明，調(diào)整培養(yǎng)基后的愈傷組織不僅疏松，顏色呈黃白色，且愈傷組織生長(zhǎng)較快，適合作懸浮培養(yǎng)。

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