鄧雪柯 張學翠

摘 要：該研究從高錳地區(qū)地表水系的水樣和淤泥中分離得到了6株具有Mn（II）氧化能力的菌株MBR1～MBR6，利用甲醛肟法對6株菌株的除錳能力進行比較，發(fā)現(xiàn)MBR6>MBR5>MBR3>MBR1>MBR2>MBR4，其中MBR3、MBR5和MBR6的除錳率均在30%以上，具有進一步研究價值。

關鍵詞：地表水系 甲醛肟法 除錳

中圖分類號：X172 文獻標識碼：A 文章編號：1007-3973（2013）009-142-02

錳元素是地球地殼的主要成份之一，在自然界廣泛分布，當水中的錳含量超過一定標準時，會對工業(yè)、生活及環(huán)境產(chǎn)生不利的影響，甚至表現(xiàn)出嚴重的生理毒性，對人產(chǎn)生慢性毒害。Mn（II）多存在于地下水中，但隨著經(jīng)濟的快速發(fā)展，廠礦污水的排放，加上全球氣候惡化，洪澇災害頻繁發(fā)生，大量的含錳物質被沖刷流入河流，導致地表水中的錳含量不斷升高。地表水錳污染已成為給水處理中一個亟待解決的問題。

目前國內外除錳工藝的研究領域主要針對地下水，已取得豐富的成果，在法國、德國、保加利亞等國家的試驗性利用已取得良好的成效。但地表水方面一直未受到特別重視，從而未進行系統(tǒng)理論的研究。近年來世界各地及我國先后發(fā)現(xiàn)，眾多大小地表水系不同程度地受到錳的污染。由于地表水在含氧量、酸堿度、水系條件等方面與地下水有著很大區(qū)別，針對地下水的生物除錳工藝處理地表水時有著很大的局限性。因此篩選適合地表水系的具有除錳能力的菌株，研究其對Mn（II）的氧化去除能力有著巨大的社會經(jīng)濟效益，同時為除錳工藝的理論系統(tǒng)化發(fā)展進一步奠定基礎。

1 實驗材料

樣品為重慶“錳三角”附近廠礦周邊地表水中取得水樣和淤泥，用無菌瓶保存后帶回實驗室進行分離鑒定。

PYCM液體培養(yǎng)基：蛋白胨0.8g，酵母浸膏0.2g，MnSO4·H2O 0.2g，K2HPO4 0.1g，MgSO4·7H2O 0.2g，NaNO3 0.2g，CaCl2 0.1g，（NH4）2CO3 0.1g，定容至1000mL，pH值7。

PYCM固體培養(yǎng)基：1000mL PYCM液體培養(yǎng)基中加入15g瓊脂。

Mn（II）母液：MnSO4·H2O 0.614g，定容至200mL，終濃度1000mg/L。

TEST培養(yǎng)基：蛋白胨0.2g，酵母浸膏0.1g，NaCl 1.314g，KCl 0.056g，MgSO4·7H2O 0.924g，CaCl2 0.083g，定容至1000mL。加熱滅菌，冷卻后加入已過濾除菌的10.1mL的1M HEPES母液。

2 實驗方法

2.1 樣品的分離純化

取10mL樣品懸浮液梯度稀釋后涂布PYCM平板，置于25℃下培養(yǎng)15天，挑取棕色菌落，多次劃線分離后得到單克隆。用0.5% 鹽酸四甲基對苯二胺溶液滴加分離的菌落，初步檢測其錳（II）氧化能力。

2.2 菌株除錳能力測定

利用甲醛肟分光光度法測定。

2.2.1 標準曲線繪制

配置濃度分別為0mg/L，2 mg/L，5 mg/L，10 mg/L，20 mg/L，40 mg/L，60 mg/L，80 mg/L和100 mg/L的Mn（II）標準液。取1mL標準液，加7mL H2O，0.1mL Na2-EDTA溶液，0.1mL甲醛肟溶液，0.36mL NaOH溶液，搖勻后靜置10分鐘，加入0.6mL 氨-鹽酸羥胺溶液后加水定容至10mL，搖勻后再靜置20分鐘，隨后利用分光光度計以純水作為對照，于450nm光下測量反應液的OD值，繪制標準曲線。

2.2.2 待測菌株樣本制備

將待測菌株用1mL PYCM液體培養(yǎng)基25℃培養(yǎng)48小時后，利用10mM Tris·HCl緩沖液反復離心清洗，最后懸浮稀釋至相同菌體濃度，OD610為1.0。

取4.65mL TEST培養(yǎng)基，加入250 L Mn（II）母液，再加入100 L稀釋菌液。對照組加入100 L ddH2O。25℃振蕩培養(yǎng)48小時。

2.2.3 待測菌株除錳能力測定

將培養(yǎng)結束的菌株和對照轉移至離心管中，3000譯離心10分鐘，取上清液1mL，按照甲醛肟法測定吸光度OD450。

3 結果與分析

3.1 除錳菌株的分離篩選

通過對3處高錳地區(qū)地表水系采集的水樣和污泥樣本的梯度稀釋后涂布在PYCM固體培養(yǎng)基上，挑選棕黃色菌落，經(jīng)多次劃線純化培養(yǎng)獲得除錳菌株6株，MBR1，MBR2，MBR3，MBR4、MBR5和MBR6，滴加0.5%鹽酸四甲基對苯二胺溶液的對應菌落顏色呈深藍色。

當具有錳氧化能力的菌株在含有Mn（II）的PYCM培養(yǎng)基中生長時，能將培養(yǎng)基中的Mn（II）氧化為Mn（IV），形成棕色沉淀，使菌落表現(xiàn)出棕黃色。因此挑選棕黃色菌落更易從生態(tài)菌群中找到具有錳氧化能力的菌落。微生物的Mn（II）氧化酶可與鹽酸四甲基對苯二胺溶液氧化，產(chǎn)生顏色反應。因此利用鹽酸四甲基對苯二胺對挑選的6株除錳菌株進行顯色反應呈陽性，可以初步鑒定菌落具有氧化酶和對Mn（II）的氧化能力。

3.2 甲醛肟標準曲線的確立

在實驗結果中，我們發(fā)現(xiàn)當分析中包括100mg/L Mn（II）標準液的吸光度結果時，Mn（II）濃度與吸光度的標準曲線的R2<0.99，嚴重偏離線性關系，而當去除100mg/L標準液結果后可得到較好的線性關系。該現(xiàn)象可能由于100mg/L的Mn（II）濃度超出了甲醛肟法的測定范圍，反應過程中無法將溶液中的Mn（II）全部轉化為Mn（IV），進而導致測量結果偏離線性關系。因此，根據(jù)實驗所得結果，Mn（II）的濃度與吸光度在0-80mg/L范圍內呈線性相關，R2=0.9997。

3.3 除錳菌株除錳能力的測定

將對照ddH2O稀釋后的菌液在50mg/L Mn（II）的TEST培養(yǎng)基中培育48小時后的上清液，利用甲醛肟法測的OD450。參照甲醛肟法的標準曲線可得出上清液中殘留的Mn（II）濃度，則除錳菌株對Mn（II）的去除能力為：除錳率=（原始Mn（II）濃度-殘留Mn（II）濃度）/原始Mn（II）濃度？00%。

通過實驗結果發(fā)現(xiàn)，MRB系列菌株對Mn（II）的去除率在10.0～37.2%之間，其中以MBR3、MBR5和MBR6去除Mn（II）的能力較強，除錳率分別為30.9%，35.6%和37.2%，此能力的產(chǎn)生可能與該菌株所處的高錳環(huán)境的脅迫選擇有關。而MBR1、MBR2和MBR4除錳率分別為23.6%，19.4%和10.0%，均低于30%，這和可能與這類細菌在高錳環(huán)境的生存機制有關，它們可能不需要通過氧化Mn（II）來調整所處微環(huán)境的Mn（II）濃度，而是更多依靠自身對錳的耐受能力或自然界菌群中其它菌對Mn（II）的協(xié)同吸附去除機制。

4 結論和討論

目前關于除錳菌株的研究多集中于地下水方面，從地下水相關環(huán)境分離具備除錳能力的菌株。但本研究針對的地表水系的環(huán)境條件與地下水系的相差很大。（1）地表水的pH值和溶解氧含量均較地下水高，適于地下水低pH值條件下的氧化Mn（II）的細菌不一定適應地表水系環(huán)境。（2）地表水中鐵離子含量低，對除錳的干擾較地下水小。（3）地表水源的水質較地下水復雜，影響到針對地下水的錳氧化細菌的除錳效果穩(wěn)定性。因此目前常用的處理地下水的錳氧化細菌在地表水系中無法穩(wěn)定的發(fā)揮效果，故針對地表水進行生物除錳，需要挑選適合地表水的錳氧化細菌。

本研究從高錳地區(qū)的地表水系中分離純化后獲得6株具有除錳能力的菌株，其中有3株菌株MBR3、MBR5和MBR6的氧化Mn（II）能力較強，48小時的除錳效率率達到30%以上。從實驗結果看出，地表水系中篩選到的除錳菌株氧化去除Mn（II）的效率低于部分文獻報道的針對地下水的除錳菌株，其原因可能存在于多方面：（1）地表水由于自然的流動更替，雖然會出現(xiàn)Mn（II）濃度超標，但仍低于地下水的濃度，因此生存在地表水系的微生物只需要進化出適合地表水的氧化除錳能力。（2）地表水系水質復雜，生物群落中微生物的種類遠遠多于地下水系，其個體雖然除錳能力不強，但群落間可通過協(xié)同增強作用，共同對Mn（II）進行氧化，以降低Mn（II）濃度。（3）地表水系中的部分微生物生存依賴對高Mn（II）濃度的耐受性強于氧化去除能力。因此隨著對分離到的地表水系除錳菌株的除錳機制，耐錳能力進一步進行研究，與地下水系除錳菌株進行比較，可揭示不同條件下微生物除錳的原理，以便進一步開發(fā)投入環(huán)保應用。

（基金項目：四川省科技廳應用基礎項目資助（07JY029-034））

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