朱建軍　王曉宇　胡萍　宋朱諭

摘 要：在黔式臘肉加工過(guò)程中，通過(guò)注射添加木瓜蛋白酶和中性蛋白酶，促進(jìn)蛋白質(zhì)降解，以利于風(fēng)味物質(zhì)的形成。結(jié)果表明：黔式臘肉最優(yōu)酶解條件為木瓜蛋白酶添加量0.001%、中性蛋白酶添加量0.001%、食鹽添加量4%、酶解時(shí)間48h；添加蛋白酶樣品中非蛋白氮（NPN）、氨基態(tài)氮（AN）、揮發(fā)性鹽基氮（TVBN）的含量以及游離氨基酸（FAA）種類和總量均高于未加酶樣品；經(jīng)GC-MS檢測(cè)，添加蛋白酶樣品中有65種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，比未添加蛋白酶樣品多10種，風(fēng)味物質(zhì)種類除烴類和羰基類化合物外，都有所增加，烴類、酚類和醇類相對(duì)含量增加，酯類相對(duì)含量減少。

關(guān)鍵詞：黔式臘肉；木瓜蛋白酶；中性蛋白酶；風(fēng)味物質(zhì)

中圖分類號(hào)：TS251.6 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2013）08-0016-05

黔式臘肉作為我國(guó)傳統(tǒng)肉制品的重要組成部分及典型代表，因其色澤美觀、香氣濃郁、味道獨(dú)特而著稱。傳統(tǒng)工藝由于加工工藝落后、生產(chǎn)周期長(zhǎng)、受季節(jié)限制大等問(wèn)題[1]，正逐漸被現(xiàn)代臘肉加工工藝代替，但是現(xiàn)代工藝生產(chǎn)的臘肉風(fēng)味不及傳統(tǒng)工藝濃郁。為此，研究人員對(duì)低鹽處理、紫外輻照和臭氧處理等工藝進(jìn)行了研究，以期促進(jìn)臘肉風(fēng)味的形成及改善[2-3]。

生物酶對(duì)臘肉風(fēng)味的形成有著重要的作用，它能夠促進(jìn)蛋白質(zhì)水解以及脂肪的水解及氧化，生成肽、游離氨基酸、游離脂肪酸等重要的風(fēng)味前體物質(zhì)。由于內(nèi)源酶作用機(jī)理較復(fù)雜，影響因素較多[4-9]，多數(shù)研究者從外源酶著手研究其對(duì)肉制品風(fēng)味的影響。Fernández等[10]將胰脂酶添加到發(fā)酵香腸中，發(fā)現(xiàn)其可以促進(jìn)風(fēng)味的形成，還可以縮短成熟時(shí)間；羅珺等[11-12]分別將木瓜蛋白酶、胰蛋白酶添加到臘肉中，提高了游離氨基酸和風(fēng)味物質(zhì)的含量；閆文杰等[13]從豬肉中提取組織蛋白酶和脂肪酶添加到臘肉原料肉中，大部分風(fēng)味物質(zhì)都有所增加；田懷香等[14]采用Protaxnex和Flavourzyuie酶組合水解金華火腿制備提取物，得到產(chǎn)品風(fēng)味較佳；穆建穩(wěn)等[15]將中性蛋白酶添加到臘牛肉中，促進(jìn)了蛋白質(zhì)的降解。但是關(guān)于向黔式臘肉中添加酶制劑還未見(jiàn)研究，本研究向黔式臘肉中添加木瓜蛋白酶和中性蛋白酶，并進(jìn)行優(yōu)化組合，在較短時(shí)間內(nèi)使蛋白質(zhì)降解，促進(jìn)臘肉獨(dú)特風(fēng)味的形成。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮豬肉 貴州黔五福食品有限公司；木瓜蛋白酶（酶活105U/g）、中性蛋白酶（酶活105U/g） 北京索萊寶科技有限公司；其他實(shí)驗(yàn)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ZSJ型鹽水注射器、GR50型真空滾揉機(jī) 諸城市雙春包裝機(jī)械公司；KYXX型煙熏爐 嘉興市凱斯不銹鋼機(jī)械制造有限公司；FA2004N型電子天平 上海菁海儀器有限公司；78-1型磁力攪拌器 金壇市華峰儀器有限公司；L-8800型氨基酸自動(dòng)分析儀 日本日立公司；HP6890-5975C型GC-MS聯(lián)用儀 美國(guó)安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 黔式臘肉加工工藝

鮮肉切塊→腌制（木瓜蛋白酶、中性蛋白酶溶解于鹽水，注射到豬肉中，真空滾揉30min后干腌3d）→烘烤、煙熏（70℃烘烤3h后煙熏24h）→自然風(fēng)干（24h）→真空包裝得成品。

1.3.2 取樣

在臘肉生產(chǎn)過(guò)程中分別于原料肉（A樣）、腌制結(jié)束（B樣）、熏烤結(jié)束（C樣）、自然風(fēng)干24h后的成品（D樣）工藝點(diǎn)隨機(jī)取相同質(zhì)量的樣品，每次每個(gè)工藝點(diǎn)取樣500g，取出的樣品待用。

1.3.3 總氮、非蛋白氮、氨基態(tài)氮及揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定

總氮測(cè)定（total nitrogen，TN）：參照GB 5009.5—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)：食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》中的凱氏定氮法；非蛋白氮的測(cè)定（non-protein nitrogen，NPN）：參照趙改名等[16]的方法；氨基態(tài)氮（amino nitrogen，AN）的測(cè)定：參照文獻(xiàn)[17]；揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen）測(cè)定：參照GB/T 5009.44—2003《肉與肉制品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》中半微量定氮法。

1.3.4 游離氨基酸測(cè)定

稱取樣品1.00g加入到50mL水中，振蕩混勻，取出4mL溶液，加入到4mL 100g/L磺基水楊酸溶液中沉淀12h，10000r/min離心25min，取一定體積的上清液調(diào)至pH2左右，用0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，濾液上機(jī)用自動(dòng)氨基酸分析儀測(cè)定。

色譜條件：離子交換柱：2.6mm×150mm；可見(jiàn)光檢測(cè)器：波長(zhǎng)570nm、440nm；流動(dòng)相：檸檬酸和檸檬酸鈉緩沖液；流速：0.225mL/min；進(jìn)樣量：50μL。

1.3.5 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定

稱取樣品10g，切碎后置于50mL固相微萃取儀采樣瓶中，插入裝有2cm-50/30μm DVB/CAR/PDMS StableFlex纖維頭的手動(dòng)進(jìn)樣器，在85℃頂空萃取30min取出，快速移出萃取頭并立即插入氣相色譜儀進(jìn)樣口（溫度250℃）中，熱解吸3min進(jìn)樣。

氣相色譜條件：色譜柱為ZB-5MSI 5% Phenyl-95% DiMethylpolysiloxane（30m×0.25mm，0.25μm）彈性石英毛細(xì)管柱，柱溫45℃（保留2min），以4℃/min升溫至220℃，保持2min；汽化室溫度250℃；載氣為高純He （99.999%）；柱前壓53kPa，載氣流量1.0mL/min；不分流進(jìn)樣；溶劑延遲時(shí)間：1.5min。

質(zhì)譜條件：離子源為（electron ionization，EI）源；離子源溫度230℃；四極桿溫度150℃；電子能量70eV；發(fā)射電流34.6μA；倍增器電壓1216V；接口溫度280℃；質(zhì)量范圍m/z 20～450。

1.3.6 感官評(píng)定

由實(shí)驗(yàn)室10人組成感官評(píng)定小組。以色澤（表面、內(nèi)部以及整體）、質(zhì)地（表面、內(nèi)部）、口感（咸度、甜度及硬度）和風(fēng)味（煙熏味及臘香味）作為感官評(píng)定的指標(biāo)。采用九點(diǎn)標(biāo)度法[18]，滿分9分，9=極好，8=良好，7=好，6=次好，5=一般，4=一般以下，3=差，2=很差，l=極差。

2 結(jié)果與分析

2.1 黔式臘肉酶解工藝優(yōu)化

圖 1 各單因素對(duì)黔式臘肉風(fēng)味的影響

Fig.1 Effect of different dosages of papain and neutral protease， salt content and hydrolysis time on the sensory score of Guizhou bacon

分別對(duì)木瓜蛋白酶添加量、中性蛋白酶添加量、食鹽添加量和酶解時(shí)間進(jìn)行單因素試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖1。由單因素試驗(yàn)結(jié)果初步確定，選擇木瓜蛋白酶添加量0.001%、中性蛋白酶添加量0.001%、食鹽添加量4%、酶解時(shí)間36h。

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合感官評(píng)定得分以及氨基態(tài)氮含量，確定兩種蛋白酶添加量（g酶/g肉）、食鹽添加量和酶解時(shí)間，進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果如表1所示。以黔式臘肉中氨基態(tài)氮含量為評(píng)定指標(biāo)，由極差分析可得出影響其酶解的因素主次順序?yàn)椋篈木瓜蛋白酶添加量>B中性蛋白酶添加量>C食鹽添加量>D酶解時(shí)間，最優(yōu)酶解條件為A3B3C2D3，即木瓜蛋白酶添加量0.005%、中性蛋白酶添加量0.005%、食鹽添加量4%、酶解時(shí)間48h。經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，此時(shí)氨基態(tài)氮含量為318.72mg/100g。以感官評(píng)定得分為評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)極差分析得出黔式臘肉最優(yōu)酶解條件為A2B2C3D3，即木瓜蛋白酶添加量0.001%、中性蛋白酶添加量0.001%、食鹽添加量6%、酶解時(shí)間48h。雖然食鹽在臘肉加工儲(chǔ)藏過(guò)程中具有抑菌防腐作用，添加蛋白酶能促進(jìn)蛋白質(zhì)水解，但是鹽分含量過(guò)高對(duì)健康不利，蛋白酶添加量過(guò)高產(chǎn)品感官欠佳并且會(huì)提高經(jīng)濟(jì)成本。綜合考慮影響黔式臘肉酶解的因素，最優(yōu)酶解條件為A2B2C2D3，即木瓜蛋白酶添加量0.001%、中性蛋白酶添加量0.001%、食鹽添加量4%、酶解時(shí)間48h。在此條件下所得黔式臘肉產(chǎn)品整體色澤鮮明、口感和質(zhì)地較好、臘香味明顯。

2.2 酶解工藝優(yōu)化臘肉與未加酶處理臘肉的比較分析

2.2.1 非蛋白氮含量比較

非蛋白氮是除蛋白質(zhì)以外的多肽、短肽及游離氨基酸等小分子含氮物質(zhì)，是重要的風(fēng)味前體物質(zhì)，能夠直接反映出臘肉中蛋白質(zhì)的降解程度。由圖2可看出，未加酶與加酶的樣品，非蛋白氮含量在加工過(guò)程中都呈上升趨勢(shì)，由原料肉的0.55%分別上升到1.53%和3.02%，這是黔式臘肉加工過(guò)程中蛋白質(zhì)發(fā)生降解的結(jié)果。未加酶的樣品在腌制結(jié)束后非蛋白氮含量下降，是由于腌制階段非蛋白氮隨著鹽水的滲出而流失。添加蛋白酶的樣品非蛋白氮的含量高于未添加蛋白酶的樣品，并且差異顯著（P<0.05），這與加入蛋白酶促進(jìn)了蛋白質(zhì)分解生成多肽以及氨基酸有關(guān)。

圖 2 黔式臘肉加工過(guò)程中非蛋白氮變化

Fig.2 Change in NPN content during Guizhou bacon production

2.2.2 氨基態(tài)氮含量比較

氨基態(tài)氮主要來(lái)自于蛋白質(zhì)和多肽的降解，在一定程度上也能夠反映出蛋白質(zhì)的水解程度，水解產(chǎn)物氨基酸是臘肉中重要的風(fēng)味前體物質(zhì)，對(duì)臘肉的風(fēng)味有重要影響。由圖3可知，在黔式臘肉加工過(guò)程中，未加酶與加酶樣品氨基態(tài)氮均呈上升趨勢(shì)。加酶后氨基態(tài)氮含量由原料肉的150.24mg/100g上升到成品的281.51mg/100g，增加了1.87倍，比未加酶成品的含量高57.86mg/100g。在腌制階段，未加酶樣品氨基態(tài)氮含量隨鹽水流失而下降，加酶樣品中氨基態(tài)氮雖有流失但含量依然顯著增加，這是由于添加蛋白酶的樣品在腌制階段蛋白質(zhì)劇烈水解，之后的過(guò)程中外源蛋白酶活性逐漸降低。

圖 3 黔式臘肉加工過(guò)程中氨基態(tài)氮變化

Fig.3 Change in AN content during Guizhou bacon production

2.2.3 揮發(fā)性鹽基氮含量比較

揮發(fā)性鹽基氮是蛋白質(zhì)分解生成的氨及胺類等堿性含氮物質(zhì)，其含量標(biāo)志著肉及肉制品的腐敗變質(zhì)程度。由圖4可看出，兩種樣品在加工過(guò)程中，揮發(fā)性鹽基氮都在不斷上升，未加酶和加酶樣品的揮發(fā)性鹽基氮由原料肉的6.26mg/100g分別上升到成品的16.54mg/100g和20.42mg/100g，并且腌制階段上升速率較快。在整個(gè)加工過(guò)程中，加酶樣品的揮發(fā)性鹽基氮含量均高于未加酶樣品，這是由于添加蛋白酶加快了氨基態(tài)氮和多肽氮的生成速度，在一定程度上促進(jìn)了揮發(fā)性鹽基氮的產(chǎn)生[19]。

圖 4 黔式臘肉加工過(guò)程中揮發(fā)性鹽基氮變化

Fig.4 Change in TVBN content during Guizhou bacon production

2.2.4 游離氨基酸比較

臘肉樣品中添加蛋白酶，能夠促進(jìn)蛋白質(zhì)降解生成游離氨基酸，游離氨基酸又可以進(jìn)一步反應(yīng)形成揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)[20]。因此游離氨基酸含量能反應(yīng)出臘肉中蛋白質(zhì)降解程度以及風(fēng)味特征。由表2中未加蛋白酶的樣品與添加蛋白酶的樣品游離氨基酸含量對(duì)比可知，添加外源蛋白酶后，游離氨基酸的總含量增加，比未加蛋白酶的樣品增加了30.98%。大多數(shù)游離氨基酸的含量都有所增加，其中以組氨酸增加最多，其次是酪氨酸、谷氨酸和賴氨酸。此外，添加蛋白酶樣品中檢測(cè)出纈氨酸，且含量較高（120.6mg/100g），這在未加蛋白酶樣品中未檢測(cè)到。天冬氨酸、絲氨酸、谷氨酸、賴氨酸和組氨酸的含量與肉制品的風(fēng)味密切相關(guān)，添加外源蛋白酶后，這幾種游離氨基酸的含量都有所增加，有利于黔式臘肉風(fēng)味的形成。添加蛋白酶后，必需氨基酸由6種增加到7種，總含量415.04mg/100g增加到640.69mg/100g，臘肉產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值也有一定程度的提高。

2.2.5 風(fēng)味成分比較

經(jīng)SPME-GC-MS檢測(cè)分析，得出黔式臘肉未加酶與加酶樣品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分及相對(duì)含量結(jié)果見(jiàn)表3。未添加蛋白酶與添加蛋白酶樣品的主體風(fēng)味物質(zhì)為醇類、烴類、酚類、酯類和羰基化合物，添加蛋白酶樣品中共鑒定出65種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分，比未添加蛋白酶樣品多10種，這說(shuō)明添加外源蛋白酶促進(jìn)了蛋白質(zhì)降解，生成更多的游離氨基酸，進(jìn)而促進(jìn)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的形成。

揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類及相對(duì)含量分析結(jié)果見(jiàn)表4。添加蛋白酶后，風(fēng)味物質(zhì)種類除烴類和羰基類化合物外，都有所增加。其中，酚類、醇類和其他類化合物增加3種，酸類增加2種，酯類增加1種。對(duì)風(fēng)味物質(zhì)相對(duì)含量而言，烴類、酚類和醇類分別增加了3.87%、3.72%和2.76%，酯類減少了10.11%，羰基類、酸類和其他類化合物變化不大。

3 結(jié) 論

3.1 由木瓜蛋白酶和中性蛋白酶組合酶解正交試驗(yàn)結(jié)果得出黔式臘肉最優(yōu)酶解條件為：木瓜蛋白酶添加量0.001%、中性蛋白酶添加量0.001%、食鹽添加量4%、酶解時(shí)間48h。

3.2 添加蛋白酶樣品，非蛋白氮、氨基態(tài)氮、揮發(fā)性鹽基氮的含量以及游離氨基酸種類和總量均高于未加酶樣品，加入蛋白酶促進(jìn)了蛋白質(zhì)降解以及風(fēng)味物質(zhì)的形成。

3.3 添加蛋白酶樣品中共鑒定出65種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分，比未添加蛋白酶樣品多10種。添加蛋白酶后，風(fēng)味物質(zhì)種類除烴類和羰基類化合物外，都有所增加。烴類、酚類和醇類相對(duì)含量增加，酯類相對(duì)含量減少，羰基類、酸類和其他類化合物變化不大。

參考文獻(xiàn)：

[1] 周光宏， 趙改名， 彭增起. 我國(guó)傳統(tǒng)腌臘肉制品存在的問(wèn)題及對(duì)策[J]. 肉類研究， 2003， 17（1）： 3-7.

[2] 馮彩平， 任發(fā)政， 高平. 低鹽臘肉的研制及其貯藏性能的研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)， 2004， 30（5）： 131-133.

[3] Talon R， MONTEL M C， GANDEMER G， et al. lipolysis of pork fat by Staphylococcus warneri， S. saprophyticus and Micrococcus varians[J]. Applied Microbiology and Biotechnology， 1993， 38（5）： 606-609.

[4] Huan Yanjun， Zhou Guanghong， Zhao Gaiming， et al. Changes in flavor compounds of dry-cured Chinese Jinhua ham during processing[J]. Meat Science， 2005， 71（2）： 291-299.

[5] 謝婷， 李誠(chéng). 內(nèi)源性蛋白酶在宰后豬肉成熟過(guò)程中的作用[J]. 肉類研究， 2008， 22（6）： 11-14.

[6] Garcia-Garrido J A， Quiles-Zafra R， TaPiador J， et al. Activity of cathepsin B， D， H and L in Spanish dry-cured ham of normal and defeetivetexture[J]. Meat Science， 2001， 56（1）： l-6.

[7] Toldrd F， Aristoy M C， Flores M. Contribution of muscle aminopeptidases to flavor development in dry-cured ham[J]. Food Research International， 2000， 33（3）： 181-185.

[8] 趙改名， 周光宏， 徐幸蓮. 肌肉內(nèi)源蛋白酶及其在干腌火腿加工過(guò)程中的作用[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)， 2003， 29（4）： 70-75.

[9] 陸瑞琪， 郇延軍， 孫敬， 等. 金華火腿現(xiàn)代化生產(chǎn)過(guò)程中脂質(zhì)及內(nèi)源酶的變化特點(diǎn)[J]. 食品與機(jī)械， 2008， 24（3）： 17-20.

[10] Fernández M， de la HOZ L， Díaz O， et al. Effect of the addition of pancreatic lipase on the ripening of dry-fermented sausages-Part 2. Free fatty acids， short-chain fatty acids， carbonyls and sensory quality[J]. Meat Science， 1995， 40（3）： 351-362.

[11] 羅珺， 崔建云， 陳尚武， 等. 添加木瓜蛋白酶對(duì)臘肉風(fēng)味的影響研究[J]. 肉類研究， 2005， 19（10）： 25-28.

[12] 羅珺， 崔建云， 陳尚武， 等. 胰蛋白酶對(duì)臘肉風(fēng)味形成的影響研究[J]. 食品工業(yè)科技， 2006， 27（12）： 61-64.

[13] 閆文杰， 李興民， 何立千， 等. 添加酶對(duì)快速腌制臘肉風(fēng)味的影響[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)， 2008， 34（4）： 175-177.

[14] 田懷香， 王璋， 許時(shí)嬰. 酶法提取金華火腿中的風(fēng)味前體物質(zhì)[J]. 食品與機(jī)械， 2005， 21（2）： 1-5.

[15] 穆建穩(wěn)， 董全， 李洪軍. 中性蛋白酶對(duì)臘牛肉加工中蛋白質(zhì)影響的研究[J]. 食品研究與開(kāi)發(fā)， 2012， 33（8）： 14-17.

[16] 趙改名， 周光宏， 柳艷霞， 等. 肌肉非蛋白氮和游離氨基酸在金華火腿加工過(guò)程中的變化[J]. 食品科學(xué)， 2006， 27（2）： 33-37.

[17] 黃群， 麻成金， 歐陽(yáng)玉祝， 等. 傳統(tǒng)湘西酸肉發(fā)酵動(dòng)態(tài)與Nisin保鮮試驗(yàn)[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)， 2008， 34（4）： 167-170.

[18] 周明超， 張春暉， 郭偉. 磷酸鹽對(duì)西式蒸煮火腿質(zhì)構(gòu)影響研究[J]. 食品研究與開(kāi)發(fā)， 2000， 27（9）： 143-146.

[19] 甘春生， 郇延軍， 邵利君， 等. 外源酶調(diào)控火腿片成熟技術(shù)研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)， 2010， 36（9）： 155-160.

[20] 成堅(jiān)， 劉曉艷. 酶解方法對(duì)雞肉風(fēng)味的影響[J]. 食品工業(yè)科技， 2005， 26（2）： 82-84.