胡國元，李超影，陳 默，張 芊，張 哲

(武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院，綠色化工過程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北省新型反應(yīng)器與綠色化學(xué)工藝重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430074)

0 引 言

近年來，關(guān)于香菇多糖抑菌活性的報(bào)道較多，香菇多糖對枯草芽胞桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌都有一定的抑制作用，對雞白痢沙門氏桿菌和禽多殺性巴氏桿菌也有抑制作用[1-2]；金針菇多糖具有提高免疫力、保肝和抗氧化等功能[3]，但關(guān)于其抑菌活性的報(bào)道較少；另外，有關(guān)香菇菌柄多糖抑菌活性的報(bào)道較少.本實(shí)驗(yàn)測定了金針菇胞外多糖、香菇胞外多糖和香菇菌柄多糖對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念球菌的抑制作用，同時(shí)對香菇菌柄多糖的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，為食用菌多糖作為殺菌劑的開發(fā)和應(yīng)用提供了依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材 料

1.1.1 菌株 金針菇(Flammulinavelutipes)12、香菇(Lentinusedodes)39、大腸桿菌(Escherichiacoli)8099、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC6538和白色念球菌(Candidaalbicans)ATCC10231，均由本實(shí)驗(yàn)室保藏.

1.1.2 香菇菌柄 市售鮮香菇，取菌柄置于60 ℃烘箱內(nèi)烘干，粉碎過孔徑為0.15 mm篩子，密封，置于干燥器中保藏，備用.

1.1.3 儀器與試劑 主要儀器：恒溫培養(yǎng)箱(DNP-9162，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)、恒溫?fù)u床(SKY-200B，上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司)、超凈工作臺(tái)(CJ-2D，天津市泰斯特儀器有限公司)、游標(biāo)卡尺(申工0～150 mm，上海申韓量具有限公司)、電子天平(BL-220L，島津國際貿(mào)易上海有限公司)、振蕩器(VTX3500，LMS CO.,LTD.)、離心機(jī)(TG16-WS，長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司)、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9053A，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(R-201，鄭州長城科工貿(mào)有限公司)、循環(huán)水式多用真空泵(SHB-IIIA，鄭州長城科工貿(mào)有限公司)、數(shù)顯恒溫水浴槽(DK-S24，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)、高壓滅菌鍋(LDZM-60KCS，上海申安醫(yī)療器械廠)、細(xì)菌過濾器(E-100，北京眾益中和生物技術(shù)有限公司)和分光光度計(jì)(722E，天津市普斯特儀器有限公司)等.主要試劑：乙醇(分析純)、濃硫酸(分析純)、苯酚(分析純)、葡萄糖(化學(xué)純)、磷酸二氫鉀(化學(xué)純)、磷酸氫二鉀(化學(xué)純)和硫酸鎂(化學(xué)純)等，均為市售.

1.1.4 培養(yǎng)基 完全培養(yǎng)基(Complete Yeast Extract Medium)[4-5]，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(Beef extract Prptone Medium)[2]，馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(Potato Dextrose Agar Medium，PDA)：馬鈴薯20 g ，葡萄糖2 g，瓊脂18 g，加入蒸餾水1 000 mL，pH 7.2～7.4.

1.2 方 法

1.2.1 金針菇和香菇的液體培養(yǎng) 按文獻(xiàn)[4-5]的方法進(jìn)行金針菇和香菇的液體培養(yǎng).

1.2.2 發(fā)酵液中胞外多糖的提取 金針菇和香菇終止發(fā)酵后，按文獻(xiàn)[4-5]的方法進(jìn)行發(fā)酵液中胞外多糖的提取，得多糖粗制品，60 ℃烘干，置于干燥器中保藏，備用.

1.2.3 香菇菌柄多糖的熱水浸提 影響多糖提取得率的主要因素有浸提溫度、浸提時(shí)間和料液比等[6-7]. 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇料液比、浸提溫度、浸提時(shí)間3項(xiàng)為考察因素，各取3個(gè)水平，即料液比(g∶mL)：1∶20，1∶30，1∶40，浸提時(shí)間：0.5，1.0，1.5 h，浸提溫度：96，98，100 ℃，進(jìn)行L9(33)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)(見表1). 取27個(gè)250 mL三角瓶，分為9組，編號(hào)1～9組，每組重復(fù)3次，在每個(gè)三角瓶中加入1.0 g香菇菌柄粉末，按料液比加入蒸餾水，封口，恒溫浸提一段時(shí)間，浸提兩次，合并兩次浸提液，多糖分離工藝同1.2.2. 采用苯酚-硫酸法[8]測定浸提液中多糖的含量，通過比較9個(gè)處理組浸提液中多糖的含量確定最優(yōu)熱水浸提方案.

表1 熱水浸提法正交試驗(yàn)L9(33)因素及水平Table 1 Factors and Levels of orthogonal tests of hot water extraction method

1.2.4 微波法與熱水浸提法復(fù)合提取香菇柄多糖 采用1.2.3的最優(yōu)熱水浸提料液比，選定微波爐的功率為480 W，微波處理時(shí)間設(shè)計(jì)4個(gè)水平，即為1、2、3、4 min，微波處理后按1.2.3的最優(yōu)熱水浸提方案進(jìn)行，通過比較4個(gè)處理組浸提液中多糖的含量確定最優(yōu)微波處理時(shí)間.

1.2.5 多糖母液的配制 將發(fā)酵法制備的金針菇、香菇胞外多糖和采用優(yōu)化的微波法與熱水浸提法復(fù)合提取香菇菌柄多糖粗制品溶于蒸餾水中，配制成50 mg·mL-1的粗多糖溶液.采用苯酚-硫酸法[8]測定粗多糖溶液中多糖的含量，經(jīng)孔徑為0.45 μm微孔濾膜過濾，得到無菌濾液，置于冰箱(4 ℃)中保藏，備用.

1.2.6 供試菌懸液的制備 將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念球菌分別接種到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基制成的斜面上，分別置于恒溫培養(yǎng)箱中37、37、28 ℃培養(yǎng)24 h，進(jìn)行菌株活化，活化好后，分別挑取一環(huán)各菌菌苔，用無菌生理鹽水進(jìn)行稀釋，制成含菌量為106～108cfu·mL-1[2,9]，置于冰箱(4 ℃)中保藏，備用.

1.2.7 濾紙片的制備 用打孔器將定性濾紙加工成直徑為6.0 mm的圓形濾紙片，滅菌備用.

1.2.8 抑菌實(shí)驗(yàn)及抑菌圈直徑測定 在固體培養(yǎng)基平板上加入200 μL菌懸浮液并涂布均勻，做成含菌平板，將已滅菌的濾紙片放入一定濃度的多糖無菌溶液中浸泡30 min，對照同步處理；用滅菌鑷子夾出各濾紙片貼于各菌營養(yǎng)平板上，并加對照處理，重復(fù)三次，置于恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h，取出，用十字交叉法，測量抑菌圈直徑大小，取平均值[2].

1.2.9 最小抑菌濃度(MIC)的測定 將待測多糖水溶液用2倍稀釋法[10]稀釋成一系列溶液，每個(gè)濃度多糖溶液的抑菌實(shí)驗(yàn)方法同1.2.9，以有抑菌圈的最低濃度為最小抑制濃度.

1.2.10 數(shù)據(jù)分析方法 采用Microsoft Excel 2003 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 香菇菌柄多糖熱水浸提法的正交試驗(yàn)

香菇菌柄多糖熱水浸提法的正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見表2.

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal design tests

注：表中數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)試驗(yàn)的平均值，以下同.

由表2可知，根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，極差R的值越大，說明此因素對實(shí)驗(yàn)的影響越大.由于RA>RC>RB，所以，3個(gè)影響因素中A(料液比)對香菇菌柄多糖的提取效率影響最大，其次為C(浸提溫度)，影響程度最小的是B(浸提時(shí)間)，影響多糖浸提效率的主次順序是A>C>B. 從表2還可知，A因素中K2值最大，B因素中K3值最大，C因素中K1值最大，即A2B3C1為香菇菌柄多糖的提取的最佳處理組，提取香菇菌柄多糖的最佳條件為：料液比為1∶30(g∶mL)，浸提時(shí)間為1.5 h，浸提溫度為96 ℃，浸提2次，香菇菌柄浸提液中多糖的含量達(dá)5.19%.

2.2 微波處理對香菇菌柄多糖熱水浸提法影響的單因素試驗(yàn)

由表3可知，在最優(yōu)熱水浸提條件下，最佳的微波處理時(shí)間為3 min，經(jīng)微波預(yù)處理后，熱水浸提法提取多糖的含量為5.68%，比最優(yōu)熱水浸提法提取多糖的含量高出0.48%.

表3 微波處理時(shí)間對多糖提取的影響Table 3 Effects of microwave time on extracting ofpolysaccharide

注：微波爐的功率為480 W.

2.3 各多糖母液中多糖的含量測定

50 mg·mL-1金針菇胞外粗多糖溶液中胞外多糖的含量為8.5 mg·mL-1，50 mg·mL-1香菇胞外粗多糖溶液中胞外多糖的含量為4.8 mg·mL-1, 50 mg·mL-1香菇菌柄多糖溶液中多糖的含量為9.3 mg·mL-1；抑菌實(shí)驗(yàn)時(shí)，將香菇菌柄多糖母液中多糖的質(zhì)量濃度稀釋為4.8 mg·mL-1(與香菇胞外多糖母液的多糖含量一致，便于評價(jià)同一濃度下兩種香菇多糖的抑菌活性的差異).

2.4 金針菇胞外多糖、香菇胞外多糖和香菇菌柄多糖的抑菌活性

由表4可知，金針菇胞外多糖對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念球菌均無抑制作用；香菇胞外多糖對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念球菌均有抑制作用，其中對大腸桿菌的抑制作用效果最好，結(jié)果與張嫚[2]等的研究結(jié)論相似，香菇多糖對革蘭氏陰性菌的抑制作用強(qiáng)于革蘭氏陽性菌；香菇菌柄水溶性多糖對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念球菌亦均有抑制作用，但抑菌效果均較差；香菇胞外多糖與香菇菌柄水溶性多糖之間的抑菌活性存在差異，可能與它們的多糖結(jié)構(gòu)不同有關(guān)，金針菇胞外多糖對供試3株菌株無抑制作用，有待進(jìn)一步探討.

表4 金針菇胞外多糖、香菇胞外多糖和香菇菌柄多糖的抑菌活性Table 4 Antimicrobial activities of F. velutipes polysaccharide and L. edodes polysaccharide

注：濾紙片直徑6.00 mm，實(shí)驗(yàn)組金針菇胞外多糖的質(zhì)量濃度為8.5 mg·mL-1，香菇胞外多糖和香菇菌柄多糖的質(zhì)量濃度均為4.8 mg·mL-1.

2.5 香菇多糖對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念球菌的最小抑菌濃度(MIC)

由表5可知，香菇胞外多糖的抑菌效果隨濃度呈上升趨勢，結(jié)果與張嫚[2]等的研究結(jié)論相似；香菇胞外多糖對大腸桿菌的最小抑菌質(zhì)量濃度為0.15 mg·mL-1，對金黃色葡萄球菌、白色念球菌的最小抑菌質(zhì)量濃度均為4.8 mg·mL-1；由表6可知，香菇菌柄多糖對大腸桿菌的最小抑菌質(zhì)量濃度為2.4 mg·mL-1，對金黃色葡萄球菌和白色念球菌的最小抑菌質(zhì)量濃度亦均為4.8 mg·mL-1；香菇胞外多糖對大腸桿菌的最小抑菌質(zhì)量濃度明顯低于香菇菌柄多糖對大腸桿菌的最小抑菌質(zhì)量濃度.

表5 香菇胞外多糖對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念球菌的最小抑菌濃度Table 5 The MIC of L. edodes exopolysaccharide against E. coli, S. aureus and C.albicans

注：“-”表示無抑菌圈；“+”表示抑菌圈在6～8 mm；“++”表示抑菌圈在8～10 mm；“+++”表示抑菌圈在10 mm以上.

表6 香菇菌柄多糖對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念球菌的最小抑菌濃度Table 5 The MIC of L. edodes polysaccharide againstE. coli, S. aureus and C. albicans

注：“-”表示無抑菌圈；“+”表示抑菌圈在6～8 mm；“++”表示抑菌圈在8～10 mm；“+++”表示抑菌圈在10 mm以上.

3 結(jié) 語

在最佳工藝條件下，香菇菌柄浸提液中多糖的含量為5.68%.金針菇胞外多糖、香菇胞外多糖和香菇菌柄多糖的抑菌活性測定結(jié)果：金針菇胞外多糖對3種供試菌株均無抑制活性，香菇胞外多糖和香菇菌柄多糖對3種供試菌株均有不同程度抑制活性.具體小結(jié)如下：

a.香菇菌柄多糖提取的最佳工藝為：料液比為1∶30(g∶mL)，微波處理3 min(微波爐的功率為480 W)，然后采用96 ℃熱水浸提1.5 h，熱水浸提2次.

b.香菇胞外多糖對3種供試菌株的抑制作用由強(qiáng)到弱依次為大腸桿菌、白色念球菌和金黃色葡萄球菌. 香菇胞外多糖對大腸桿菌具有較好的抑制作用.

c.香菇菌柄多糖對3種供試菌株的抑制作用由強(qiáng)到弱依次為白色念球菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌. 香菇菌柄多糖對3種供試菌株的抑制作用相近.

d.不同濃度的香菇胞外多糖和香菇菌柄多糖對3種供試菌株的抑制作用不同，隨著濃度的增加而增加.

e.香菇胞外多糖和香菇菌柄多糖對3種供試菌株的抑制活性存在差異， 香菇胞外多糖的抑菌效果更好些.

致謝

感謝湖北省教育廳、武漢工程大學(xué)研究生處的資助.

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