張 晨，霍 倩，李翠珍，周志俊，吳 慶

甲狀腺癌是一種最常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)腫瘤，甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)是最普遍的甲狀腺腫瘤組織類型，占甲狀腺癌的59.9%～89.0%，其病因機制復雜，發(fā)病率高[1]。促甲狀腺激素受體(thyroid stimulating hormone receptor，TSHR)基因的表達在甲狀腺癌中起著重要的作用[2]。促甲狀腺激素(thyroid stimulating hormone，TSH)通過與TSHR結合發(fā)揮作用，激活2條主要的信號轉(zhuǎn)導途徑：腺苷酸環(huán)化酶-蛋白激酶途徑和磷脂酶c-蛋白激酶c通路。甲狀腺細胞表面表達的TSHR與TSH結合，可以上調(diào)鈉/碘協(xié)同轉(zhuǎn)運體(Na+/I-symporter，NIS)的表達[3]，發(fā)揮對碘代謝功能的調(diào)節(jié)作用。如果甲狀腺中TSHR表達缺失或功能異常，就會造成甲狀腺攝取、濃縮和利用碘的功能異常[4-5]。而TSHR基因的高甲基化會影響其基因的表達，并在甲狀腺乳頭狀腫瘤的形成與預后中起重要作用[6]。目前對于表觀遺傳在甲狀腺腫瘤中的作用研究較少，本研究利用Meta分析方法研究TSHR基因的甲基化與甲狀腺乳頭狀癌之間的關系，為預防和診治甲狀腺乳頭狀癌提供參考。

1 資料與方法

1.1 文獻檢索策略 本研究以檢索詞(DNA OR TSHR OR thyroid stimulating hormone receptor)AND (thyroid OR papillary thyroid) AND (carcinoma OR cancer OR neoplasm OR tumor) AND (methylation OR epigenetic)計算機檢索Medline、Web of science、Cochrane Central、Ovid英文數(shù)據(jù)庫，檢索范圍為2000年1月—2013年4月。同時以“甲狀腺乳頭狀癌”或“甲狀腺乳頭狀腫瘤”和“TSHR”為檢索詞計算機檢索中國學術期刊全文數(shù)據(jù)庫、萬方、維普數(shù)據(jù)庫，檢索范圍為2000年1月—2013年4月。同時輔以文獻追溯和手工檢索等，收集各種雜志公開發(fā)表的學術論文、學位論文和會議摘要等。

1.2 文獻納入與排除標準 兩名獨立檢索人員根據(jù)以下標準篩選和納入文獻：(1)文獻研究方法均為流行病學研究，并分析TSHR基因甲基化與甲狀腺乳頭狀癌的關系。(2)TSHR基因甲基化的檢測方法為甲基化特異性聚合酶鏈反應(methylation specific PCR，MSP)、實時熒光定量甲基化特異性聚合酶鏈反應(real-time fluorescent quantitative methylation specific PCR，QMSP)或聯(lián)合亞硫酸氫鈉限制性內(nèi)切酶分析法(combined bisulfite restriction analysis，COBRA)。(3)所有納入文獻均有全文可供數(shù)據(jù)提取。(4)在每個研究中均有病例與對照。(5)如果是相同的病例人群在不同雜志發(fā)表，只納入其中最新或最完整的報道，避免提取重復數(shù)據(jù)。(6)每個研究的病例與對照人數(shù)均不少于3人。以下類型的研究被排除在外：動物實驗，案例報告，回顧薈萃分析，重復論文，綜述以及數(shù)據(jù)不足。相應的文獻被進一步檢索來確認是否符合納入標準，檢索不一致的地方通過兩位檢索人員討論并解決。

1.3 數(shù)據(jù)收集與質(zhì)量評價方法 檢索收集信息包括第一作者的名稱，出版的時間，研究的樣本來源、大小，甲狀腺乳頭狀癌和正?；?qū)φ战M織中的TSHR基因甲基化水平，年齡分布，腫瘤分級，以及是否存在淋巴結轉(zhuǎn)移。對于對照選擇有三種定義：(1)正常的健康人群；(2)患有甲狀腺疾病但未患有甲狀腺惡性腫瘤的患者；(3)甲狀腺乳頭狀癌患者的癌旁組織。根據(jù)紐卡斯卡-渥太華質(zhì)量評價量表(Newcastle-Ottawa scale，NOS)評價納入研究的偏倚風險，選擇其中病例-對照研究量表，評價內(nèi)容包括研究對象選擇、可比性和暴露3個方面，共9分。同時基于Meta分析的結果，應用推薦分級的評價、制定與評估(grades of recommendations assessment，development and evaluation，GRADE)系統(tǒng)推薦分級方法[7]和GRADE profiler (version 3.6)軟件評價納入文獻的總體質(zhì)量及推薦等級，分級為：(1)高質(zhì)量：我們非常確信真實的效應值接近效應估計值；(2)中等質(zhì)量：我們對效應估計值有中等程度的信心：真實值有可能接近估計值，但仍存在二者大不相同的可能性；(3)低質(zhì)量：我們對效應估計值的確信程度有限：真實值可能與估計值大不相符；(4)極低質(zhì)量：我們對效應估計值幾乎沒有信心：真實值很可能與估計值大不相同。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用STATA軟件(Stata/SE 11.0 for Windows，StataCorp LP)用于統(tǒng)計分析。使用異質(zhì)性檢驗，如果其研究間I2>50%，以及χ2檢驗(P≤0.05)都認為納入的研究存在異質(zhì)性，運用 DerSimonian-Laird 隨機效應模型[8]進行數(shù)據(jù)合并；反之則認為不存在異質(zhì)性，運用Mantel-Haenszel固定效應模型[8]進行數(shù)據(jù)合并，關聯(lián)強度用合并OR值和95%CI表示，并計算不同研究間變異。τ2值表示有多大的異質(zhì)性是可以被亞組之間的差異所解釋[9]。Meta回歸分析用于解釋異質(zhì)性的來源。病例組和對照組中TSHR基因甲基化水平的OR通過分成不同亞組進行分析，包括人群來源(中國和國外)、對照類型(自體組織和其他人群組織)、年齡分層(<45歲和≥45歲)、腫瘤TNM分期(早期和中晚期)以及是否有淋巴結轉(zhuǎn)移。敏感度分析用于評價每個研究在最終結果中的貢獻度，漏斗圖以及Egger檢驗分析其發(fā)表偏倚。

2 結果

2.1 文獻檢索結果 使用文獻檢索詞，共檢索到214篇相關文獻，進一步通過納入標準進行篩選，總共13篇文獻被挑選出來，通過閱讀分析全文，5篇文獻予以排除(見圖1)。剩余8篇文章[2，4，5，10-14]被合并分析TSHR基因甲基化與甲狀腺乳頭狀癌的風險關系(見表1)，得到的總樣本量為583份，其中甲狀腺癌組織樣本為342份，對照組樣本為241份；來自中國的研究為4篇，美國2篇，伊朗1篇，德國1篇；甲基化檢測方法主要有MSP、QMSP和COBRA。在隨機效應模型中，甲狀腺乳頭狀癌樣本中TSHR基因發(fā)生甲基化數(shù)與對照組相比的合并OR值為4.57〔95%CI(1.68，12.43)，z=2.98，P<0.01，見圖2〕。本研究GRADE系統(tǒng)評價推薦分級為中等質(zhì)量，推薦強度為中級。

表1 研究的基本情況

注：M+：樣本中甲基化數(shù)量，M-：樣本中未甲基化數(shù)量；A：同源對照(autologous control)，對照樣本來源患者自體癌旁組織；H：異質(zhì)對照(heterogeneous control)，對照樣本來源其他人群正常組織；MSP：甲基化特異性聚合酶鏈反應；QMSP：實時熒光定量甲基化特異性聚合酶鏈反應；COBRA：聯(lián)合亞硫酸氫鈉限制性內(nèi)切酶分析法；NOS：紐卡斯卡-渥太華質(zhì)量評價量表(Newcastle-Ottawa scale)

圖1 文獻納入流程圖

圖2 納入研究的森林圖

2.2 分層分析和Meta回歸 表2展示了用不同分層進行Meta分析的結果。在不同對照類型的分層分析中，對照為其他人群組織〔OR=8.51，95%CI(3.72，19.46)〕的甲狀腺乳頭狀癌樣本中TSHR基因甲基化發(fā)生的風險明顯高于自體對照樣本〔OR=3.09，95%CI(0.67，14.27)〕。通過人群來源分層時，中國人群〔OR=9.18，95%CI(5.19，16.23)〕甲狀腺乳頭狀癌中甲基化發(fā)生的風險明顯高于國外〔OR=1.99，95%CI(0.30，13.16)〕。在年齡分層分析中發(fā)現(xiàn)，年齡<45歲的人群〔OR=9.18，95%CI(5.19，16.23)〕相比年齡≥45歲的人群〔OR=1.11，95%CI(0.17，7.20)〕，其TSHR基因甲基化發(fā)生風險較高。在TNM不同分期時對甲基化發(fā)生風險進行評價，TNM Ⅰ～Ⅱ期為甲狀腺乳頭狀癌早期階段，Ⅲ～Ⅳ期為中晚期階段，TSHR基因甲基化發(fā)生風險在中晚期階段〔OR=14.12，95%CI(2.93，68.18)〕明顯高于早期〔OR=6.01，95%CI(3.21，11.28)〕。對是否有淋巴結轉(zhuǎn)移進行分析，有淋巴結轉(zhuǎn)移的甲狀腺乳頭狀癌樣本〔OR=14.29，95%CI(2.47，82.75)〕甲基化發(fā)生風險也明顯高于未觀察到淋巴結轉(zhuǎn)移的樣本〔OR=5.85，95%CI(3.15，10.85)〕。

由于本研究存在異質(zhì)性(I2=72.7%，χ2=25.65，P<0.01)，因此進行Meta回歸分析(Knapp-Hartung修正)，研究間的殘差用τ2來表示，使用限制性最大似然比法來估計研究間的變異程度。Meta回歸分析的結果表明，樣本量的差異與異質(zhì)性呈負相關(Coefficient=0.04，P<0.05，AdjustedR2=66.78%，見表3)，而其他因素諸如：男性比例、年齡、出版年份、對照類型、人群來源均與研究的異質(zhì)性無關。

2.3 敏感性分析與發(fā)表偏倚 敏感性分析表明有一項研究[5]可能是異質(zhì)性的主要來源(見表4)，當把這項研究移除后，在甲狀腺乳頭狀癌人群中TSHR基因甲基化的發(fā)生風險與對照相比異質(zhì)性明顯降低(χ2=8.91，P=0.179,I2=32.7%)。除此之外，并沒有其他單項研究能夠影響合并后的OR值。通過繪制漏斗圖，研究大致呈對稱漏斗分布(見圖3)，同時Egger檢驗(t=-0.01，P>0.05)也表明此次納入對象不存在發(fā)表偏倚，納入的文章質(zhì)量良好。

表2 促甲狀腺激素受體基因甲基化與甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生風險的分層分析

表3 Meta回歸分析

表4 異質(zhì)性分析

3 討論

甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，甲狀腺乳頭狀癌最為常見，其發(fā)病率較高，其發(fā)生、發(fā)展是包括癌基因的激活和抑癌基因失活等多因素、多步驟的復雜過程，目前普遍認為DNA的甲基化是導致抑癌基因失活的重要機制[15-16]。TSHR是甲狀腺細胞的一種特異性蛋白質(zhì)，主要分布于甲狀腺濾泡上皮細胞膜上，其主要功能是與TSH結合，通過刺激甲狀腺聚集碘全面調(diào)節(jié)甲狀腺功能。然而，對于TSHR基因的甲基化在人甲狀腺乳頭狀癌中的作用目前尚未統(tǒng)一[6，17]，TSHR表達異常以及其甲基化發(fā)生率的提高與許多甲狀腺癌發(fā)病風險之間的聯(lián)系仍在探索中[3，18]。因此本研究通過Meta分析對TSHR基因的甲基化與人甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生風險進行系統(tǒng)綜合的評價。

圖3 發(fā)表偏倚的漏斗圖

為了進一步驗證TSHR基因甲基化狀態(tài)與人甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生之間的風險，本研究綜合了342份病例以及241份對照進行Meta分析，結果表明甲狀腺乳頭狀癌樣本中TSHR基因的甲基化明顯高于對照組，是可能的危險因素。分層分析中，TSHR基因的甲基化在中國人群中以及年齡<45歲的人群中也是潛在的甲狀腺乳頭狀癌危險信號，其甲基化發(fā)生頻率是對照組的9.18倍，并且在Meta回歸中，年齡的回歸系數(shù)為-0.13，呈現(xiàn)負相關。以往研究也表明，甲狀腺癌發(fā)病高危人群為青壯年，平均年齡為40歲，之后發(fā)病率有所下降[19-20]，但在中老年人群中甲狀腺癌的預后很差[21-22]。這與本研究結果較符，因此TSHR基因甲基化也許能夠作為一個獨立的分子標志物對中國特定年齡人群的甲狀腺乳頭狀癌進行篩查。

TSHR基因的甲基化發(fā)生率與人甲狀腺乳頭狀癌的TNM臨床分期，以及是否存在淋巴結轉(zhuǎn)移都有密切聯(lián)系[2，10]，但其研究結果卻存在爭議[14，23]。通過Meta分析表明，TSHR基因甲基化的發(fā)生在甲狀腺乳頭狀癌早期已經(jīng)存在，并貫穿于整個甲狀腺乳頭狀癌的進展過程中。在甲狀腺乳頭狀癌的中晚期以及淋巴結轉(zhuǎn)移的人群中，其TSHR基因甲基化風險明顯增加，與其早期階段比較差異有統(tǒng)計學意義。本研究表明TSHR基因甲基化不僅在甲狀腺乳頭狀癌早期診斷中具有重要意義，而且對甲狀腺乳頭狀癌中晚期不良預后以及淋巴結轉(zhuǎn)移有指示作用。

還需要指出的是，本次研究仍然存在著一些局限性，首先研究所納入的8篇中英文文獻均為病例對照研究，并且樣本量較小，這與甲基化水平檢測的技術要求以及研究費用較高有關。其次一些影響因素，如生活方式、性別、遺傳因素并未納入研究中予以分析，這為以后研究提供了方向。

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