于天水 ，凌 躍 ，官大威

（1.中國政法大學 證據(jù)科學教育部重點實驗室，北京 100040；2.中國醫(yī)科大學法醫(yī)學院，遼寧 沈陽 110001；3.南通市公安局崇川分局，江蘇 南通 226006）

肌成纖維細胞（myofibroblast）是一種表達平滑肌肌動蛋白的高度分化型細胞。肌成纖維細胞參與纖維化級聯(lián)反應中纖維形成和細胞外基質(zhì)重塑兩個階段，因而在組織損傷修復中發(fā)揮了重要的作用。這一特性有望在皮膚損傷時間推斷中得到應用。本文就肌成纖維細胞的形態(tài)學特征、生物學特性及其法醫(yī)學意義進行闡述。

1 肌成纖維細胞的形態(tài)學特征

上世紀七十年代，Gabbiani等[1-2]通過電子顯微鏡技術首先對肉芽組織中的肌成纖維細胞進行了描述。隨著對肌成纖維細胞的逐漸了解與認識，Sappino等[3]發(fā)現(xiàn)，肌成纖維細胞同時具有平滑肌細胞和成纖維細胞雙重特性，存在于多種正?；虿±斫M織中，且具有相似的形態(tài)學特征。

1.1 組織學特征

肌成纖維細胞通常為梭形或者星形，具有嗜酸性或者嗜雙色性。細胞核常呈鋸齒狀、凝縮，染色質(zhì)呈顆粒狀，散在分布，核仁明顯。

1.2 超微結構特征

肌成纖維細胞主要有3個超微結構特征：（1）應力纖維（stress fibers）。在細胞膜下沿細胞長軸平行排列的束狀肌動蛋白微絲束，由β-/γ-肌動蛋白或α平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）組成[4]。（2）纖維連接復合體。細胞內(nèi)表面所形成的超成熟黏著斑，直徑為 8～30μm，由黏著斑蛋白（vinculin）、樁蛋白（paxillin）、張力蛋白（tensin）以及 αvβ3、α5β1整合素構成，為肌成纖維細胞特有結構。細胞內(nèi)的肌動蛋白微絲通過該特殊結構與細胞外的纖維連接蛋白（fibronectin）相連接[5]。 （3）細胞連接。 如縫隙連接等[6]。

1.3 特殊染色鑒別

通常情況下，通過常規(guī)HE染色較難將肌成纖維細胞與其他種類的成纖維樣細胞（fibroblastic cell，F(xiàn)BC）相鑒別。2002年 Tomasek等[7]提出，α-SMA 免疫組織化學染色是鑒定肌成纖維細胞最可靠的特異性指標。從此，α-SMA免疫組織化學染色成為鑒定肌成纖維細胞常規(guī)以及普遍認可的形態(tài)學方法，陽性染色位于細胞質(zhì)內(nèi)。如果應用熒光顯微鏡或激光共聚焦掃描顯微鏡進行觀察，陽性信號于細胞質(zhì)內(nèi)呈細絲狀排列。

2 肌成纖維細胞的生物學特性

在不同器官中，多種類型細胞在多因素作用下可以分化為肌成纖維細胞。正常情況下，肌成纖維細胞最后主要以凋亡的方式逐漸消失，不能繼續(xù)分化，是一種終末型細胞。

2.1 肌成纖維細胞的來源、分化和調(diào)節(jié)

2.1.1 成纖維細胞分化為肌成纖維細胞

目前研究[7]表明，在皮膚、肺和腎等多器官損傷修復的纖維化發(fā)展階段，部分肌成纖維細胞來源于成纖維細胞。成纖維細胞通過兩個過程才能分化為肌成纖維細胞。第一，當損傷后結締組織所承受的機械性張力（mechanical tension）或者炎癥反應引起結締組織微環(huán)境改變時，損傷周邊區(qū)局部聚集的成纖維細胞會轉化為原始肌成纖維細胞（proto-myofibroblast）。原始肌成纖維細胞內(nèi)出現(xiàn)成熟黏著斑和由β-/γ-肌動蛋白所構成的應力纖維（stress fiber）。第二，在機械性張力、細胞因子和細胞外基質(zhì)共同作用下，細胞內(nèi)成熟黏著斑分化為黏著斑，接著α-SMA黏集到應力纖維上，導致原始肌成纖維細胞最終轉變?yōu)榉只图〕衫w維細胞（differentiated myofibroblast）。此外還表達其他一些平滑肌分化的標記物，如結蛋白（desmin）等。

上述過程表明，由于肌成纖維細胞主要來源于成纖維細胞，故機械性張力、細胞因子和細胞外基質(zhì)3個因素共同影響著肌成纖維細胞的分化。

2.1.2 循環(huán)纖維細胞分化為肌成纖維細胞

1994年Bucala等[8]發(fā)現(xiàn)一類具有成纖維細胞特性的白細胞亞群，稱之為循環(huán)纖維細胞（circulating fibrocytes）。它們是骨髓來源的間充質(zhì)前體細胞，約占外周血白細胞的0.1%～0.5%。在體外，循環(huán)纖維細胞可以通過血液中單核細胞的培養(yǎng)獲得，既表達造血細胞表面抗原CD34，白細胞共同抗原CD45，單核細胞系標記物 CD11、CD13、CD32和 CD64，又分泌細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM），如Ⅰ、Ⅲ型膠原，纖維連接蛋白和波形蛋白（vimentin）。

越來越多的證據(jù)顯示，在損傷愈合期間或在一些纖維化損害中，循環(huán)纖維細胞可以出現(xiàn)在纖維灶的周圍，并且轉化為肌成纖維細胞。定位于過敏性哮喘患者支氣管黏膜膠原沉積區(qū)域的肌成纖維細胞可能來源于循環(huán)纖維細胞，研究人員[9]進一步對熒光標記的循環(huán)纖維細胞在過敏性哮喘小鼠中進行追蹤研究，間接證實了上述結果。

2.1.3 上皮細胞分化為肌成纖維細胞

在一些情況下，上皮細胞會失去極性和細胞連接，并且經(jīng)歷細胞骨架重塑，不表達其特異性標志物E-鈣粘素（E-cadherin）和緊密連接蛋白-1（zonula occluden-1），而表達間質(zhì)細胞標志物成纖維細胞特異性蛋白1和α-SMA，即上皮-間質(zhì)轉變（epithelialmesenchymal transition，EMT）。

有學者研究[10-12]腎小管上皮細胞系和腎纖維化模型發(fā)現(xiàn)，TGF-β、高級糖基化終末產(chǎn)物以及CTGF參與調(diào)節(jié)上皮細胞向肌成纖維細胞轉化的過程。另外，對特發(fā)性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）的肺泡上皮細胞進行原代培養(yǎng)和TGF-β1（100pmol/L）長時間作用后，肺泡上皮細胞會出現(xiàn)成纖維樣細胞的形態(tài)，并且α-SMA、Ⅰ型膠原、波形蛋白和結蛋白表達增加，上皮細胞標志物表達減少。IPF患者肺組織標本中肺泡上皮細胞共表達上皮細胞標志物和α-SMA，所以IPF中的肌成纖維細胞可能來源于上皮細胞[13]。實驗性小鼠肺纖維化動物模型進一步確定EMT存在于體內(nèi)，參與了纖維形成[14]。

2.2 肌成纖維細胞在損傷修復中的作用

2.2.1 收縮功能

肌成纖維細胞能夠收縮是因為表達具有收縮性質(zhì)的α-SMA，并且超成熟黏著斑大小直接影響肌成纖維細胞的收縮強度，每μm2產(chǎn)生6.6～12.6 nN的收縮力。肌成纖維細胞通過縫隙連接和超成熟黏著斑在細胞與細胞、細胞與細胞外基質(zhì)之間傳遞收縮力，誘導細胞外基質(zhì)收縮和重塑，使整個收縮過程達到同步化[6]。在皮膚創(chuàng)傷愈合過程中，肌成纖維細胞出現(xiàn)在創(chuàng)面收縮階段，減少創(chuàng)口組織的表面面積，有利于上皮再形成，以促進創(chuàng)口的愈合。另外，Gabbiani等[15]在掌筋膜攣縮綜合征和足底筋膜攣縮綜合征患者的病變腱膜組織中發(fā)現(xiàn)了具有收縮性質(zhì)的肌成纖維細胞，其收縮功能對上述綜合征的發(fā)病起到重要作用。

2.2.2 分泌功能

肌成纖維細胞具有發(fā)達的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體，為了代替壞死的組織，肌成纖維細胞分泌大量的細胞外基質(zhì)，包括膠原纖維（Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ）、蛋白多糖、金屬蛋白酶組織抑制劑-1（tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1）、TIMP-2 等。 體外細胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，肌成纖維細胞和成纖維細胞一樣可以分泌Ⅰ型和Ⅲ型膠原，其比例也基本是1∶1，但膠原合成量是成纖維細胞的3倍[16]。羊胚胎損傷愈合研究證實從孕早期（75d）到孕晚期（100d和 120 d）過程中，羊胚胎傷口中肌成纖維細胞從無到有，細胞數(shù)量逐漸增加，羊胚胎損傷修復的形式則從無瘢痕轉變?yōu)轳：坌纬蒣17]。這些研究說明肌成纖維細胞通過分泌細胞外基質(zhì)參與組織損傷修復和器官纖維化。

2.3 肌成纖維細胞的歸宿

在正常損傷修復后期肉芽組織轉變?yōu)轳：劢M織的過程中，肌成纖維細胞內(nèi)編碼凋亡蛋白的基因開始表達，是肌成纖維細胞最后消失的主要機制。有學者[4]發(fā)現(xiàn)大鼠皮膚損傷15d之后許多肌成纖維細胞發(fā)生凋亡，直至傷后30d消失。Desmoulière等[18]在大鼠皮膚損傷愈合過程中利用原位末端標記片段DNA方法檢測肌成纖維細胞的凋亡率，發(fā)現(xiàn)傷后16 d凋亡細胞顯著增加，傷后20d達到高峰，約9%～12%的細胞發(fā)生凋亡，到傷后60d則無陽性染色。電子顯微鏡結果顯示，含有吞噬溶酶體的巨噬細胞位于凋亡細胞的周圍，提示巨噬細胞的吞噬作用可能是清除凋亡小體的主要途徑。但是引起肌成纖維細胞凋亡的原因目前還不十分清楚，可能與細胞外基質(zhì)重塑時基質(zhì)金屬蛋白酶-1（matrix metalloproteinase-1，MMP-1）、MMP-2和TIMP等酶類含量變化有關[19]。Murphy等[20]進一步證實，TIMP-1滅活基質(zhì)金屬蛋白酶能夠抑制肝肌成纖維細胞的凋亡。還有研究[21-22]表明，TGF-β1通過激活p38MAPK-PI3K-AKT信號通路和抑制IL-1-iNOS表達，從而阻止肌成纖維細胞凋亡，所以創(chuàng)面愈合后創(chuàng)口內(nèi)TGF-β1的減少可能也是引起肌成纖維細胞凋亡的一個原因。

3 肌成纖維細胞的法醫(yī)學意義

Darby等[4]通過電子顯微鏡技術和免疫組織化學方法研究α-SMA在大鼠開放性創(chuàng)傷愈合肉芽組織中的表達情況，證實從傷后6 d開始α-SMA陽性染色逐漸增強，15d達到高峰，此后表達減弱，至30d沒有陽性表達。上述實驗結果提示，肌成纖維細胞的出現(xiàn)具有一定的時間規(guī)律性，為其在法醫(yī)學損傷時間推斷方面的應用奠定了基礎。Betz等[23]對人類皮膚損傷后存活不同時間的組織標本進行組織學和免疫組織化學檢測，發(fā)現(xiàn)傷后5 d內(nèi)典型肉芽組織尚未形成，肌成纖維細胞也未出現(xiàn)，但是從傷后5d至2個月的部分標本中可以找到肌成纖維細胞，所以在損傷皮膚中檢測出α-SMA陽性的肌成纖維細胞，可以認定皮膚損傷時間大約5d以上。近年來國內(nèi)也有關于肌成纖維細胞在皮膚損傷時間推斷方面的研究報道。研究人員利用免疫組織化學染色方法觀察小鼠皮膚切創(chuàng)后各個時間段α-SMA的表達情況，發(fā)現(xiàn)傷后1d α-SMA陽性細胞率開始增加，3 d陽性細胞率達高峰，傷后5～14 d陽性細胞率逐漸下降[24]。然而來源于循環(huán)纖維細胞的CD45+/α-SMA+肌成纖維細胞于傷后5d才開始出現(xiàn)在新生的肉芽組織中，并于傷后7d數(shù)量達到高峰[25]。國內(nèi)研究的表達時間均比Darby等[4，23]研究結果有所提前，其原因可能是所選用的實驗對象種屬不同，小鼠損傷愈合過程要比大鼠和人類迅速；其次可能是由于免疫組織化學染色方法不同，前人多利用ABC法，而當今SP法和免疫熒光技術敏感性更高。

[1]Gabbiani G，Ryan GB，Majne G.Presence of modified fibroblasts in granulation tissue and their possible role in wound contraction[J].Experientia，1971，27（5）：549-550.

[2]Majno G，Gabbiani G，Hirschel BJ，et al.Contraction ofgranulation tissue in vitro： similarity to smooth muscle[J].Science，1971，173（3996）：548-550.

[3]Sappino AP，Schürch W，Gabbiani G.Differentiation repertoire of fibroblastic cells：expression of cytoskeletal proteins as marker of phenotypic modulations[J].Lab Invest，1990，63（2）：144-161.

[4]Darby I，Skalli O，Gabbiani G.Alpha-smooth muscle actin is transiently expressed by myofibroblasts during experimental wound healing[J].Lab Invest，1990，63（1）：21-29.

[5]Eyden BP.Brief review of the fibronexus and its significance for myofibroblastic differentiation and tumor diagnosis[J].Ultrastruct Pathol，1993，17（6）：611-622.

[6]Gabbiani G，Chaponnier C，Hüttner I.Cytoplasmic filaments and gap junctions in epithelial cells and myofibroblasts during wound healing[J].J Cell Biol，1978，76（3）：561-568.

[7]Tomasek JJ，Gabbiani G，Hinz B，et al.Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling[J].Nat Rev Mol Cell Biol，2002，3（5）：349-363.

[8]Bucala R，Spiegel LA，Chesney J，et al.Circulating fibrocytes define a new leukocyte subpopulation that mediates tissue repair[J].Mol Med，1994，1（1）：71-81.

[9]Schmidt M，Sun G，Stacey MA，et al.Identification of circulating fibrocytes as precursors of bronchial myofibroblasts in asthma[J].J Immunol，2003，171（1）：380-389.

[10]Fan JM，Ng YY，Hill PA，et al.Transforming growth factor-beta regulates tubularepithelial-myofibroblast transdifferentiation in vitro[J].Kidney Int，1999，56（4）：1455-1467.

[11]Oldfield MD，Bach LA，F(xiàn)orbes JM，et al.Advanced glycation end products cause epithelial-myofibroblast transdifferentiation via the receptor for ad-vanced glycation end products （RAGE）[J].J Clin Invest，2001，108（12）：1853-1863.

[12]Frazier KS，Paredes A，Dube P，et al.Connective tissue growth factor expression in the rat remnant kidney model and association with tubular epithelial cells undergoing transdifferentiation[J].Vet Pathol，2000，37（4）：328-335.

[13]Willis BC，Liebler JM，Luby-Phelps K，et al.Induction of epithelial-mesenchymal transition in alveolar epithelial cells by transforming growth factor-beta1：potential role in idiopathic pulmonary fibrosis[J].Am J Pathol，2005，166（5）：1321-1332.

[14]Kim KK，Kugler MC，Wolters PJ，et al.Alveolar epithelial cell mesenchymal transition develops in vivo during pulmonary fibrosis and is regulated by the extracellular matrix[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2006，103（35）：13180-13185.

[15]Gabbiani G，Majno G.Dupuytren’s contracture： fibroblast contraction?An ultrastructural study[J].Am J Pathol，1972，66（1）：131-146.

[16]Oda D，Gown AM，Vande Berg JS，et al.Instability of the myofibroblast phenotype in culture[J].Exp Mol Pathol，1990，52（2）：221-234.

[17]Estes JM，Vande Berg JS，Adzick NS，et al.Phenotypic and functional features of myofibroblasts in sheep fetal wounds[J].Differentiation，1994，56（3）：173-181.

[18]Desmoulière A，Redard M，Darby I，et al.Apoptosis mediates the decrease in cellularity during the transition between granulation tissue and scar[J].Am J Pathol，1995，146（1）：56-66.

[19]Darby IA，Bisucci T，Pittet B，et al.Skin flap-induced regression of granulation tissue correlates with reduced growth factor and increased metalloproteinase expression[J].J Pathol，2002，197（1）：117-127.

[20]Murphy FR，Issa R，Zhou X，et al.Inhibition of apoptosis of activated hepatic stellate cells by tissue inhibitor of metalloproteinase-1 is mediated via effects on matrix metalloproteinase inhibition：implications for reversibility of liver fibrosis[J].J Biol Chem，2002，277（13）：11069-11076.

[21]Zhang HY，Phan SH.Inhibition of myofibroblast apoptosis by transforming growth factor beta1[J].Am J Respir Cell Mol Biol，1999，21（6）：658-665.

[22]Horowitz JC，Lee DY，Waghray M，et al.Activation of the pro-survival phosphatidylinositol 3-kinase/AKT pathway by transforming growth factor-beta1 in mesenchymal cells is mediated by p38 MAPK-dependent induction of an autocrine growth factor[J].J Biol Chem，2004，279（2）：1359-1367.

[23]Betz P，Nerlich A，Wilske J，et al.Time-dependent appearance of myofibroblasts in granulation tissue of human skin wounds[J].Int J Legal Med，1992，105（2）：99-103.

[24]高陽，彭雪，靳占峰，等.小鼠皮膚切創(chuàng)愈合過程中FAP和 α-SMA 的表達[J].法醫(yī)學雜志，2009，25（6）：405-408.

[25]范琰琰，官大威，王濤，等.小鼠皮膚切創(chuàng)愈合過程中纖維細胞募集和分化的時間依賴性[J].法醫(yī)學雜志，2011，27（4）：246-249.