高林林，徐念來，謝 煒，丁少成，王東京，馬麗琴 ，李佑英

骨骼及牙齒DNA的提取方法有CTAB法[1]、硅珠法[2]、壓力循環(huán)儀法[3]，但這些方法有的需要長(zhǎng)時(shí)間脫鈣、有的需要有機(jī)純化等，增加了骨骼及牙齒DNA的提取難度，同時(shí)也增加了樣品污染的概率。本研究采用AutoMate ExpressTM自動(dòng)化法醫(yī)DNA提取系統(tǒng)對(duì)骨骼及牙齒的DNA提取進(jìn)行探索，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

選取骨骼33份，牙齒15份（每份2枚），均來自于日常檢案中的不同個(gè)體。

1.2 主要儀器及試劑

1.2.1 儀器

AutoMate ExpressTM自動(dòng)化法醫(yī)DNA提取系統(tǒng)、7500定量PCR儀、9700擴(kuò)增儀、3130XL遺傳分析儀（美國(guó)AB公司），6770冷凍研磨機(jī)（美國(guó)SPEX SamplePrep公司），電鉆，牙齒粉碎器（公安部物證鑒定中心）。

1.2.2 試劑

PrepFiler Express BTATM法醫(yī)DNA提取試劑盒、Quantifiler DNA定量試劑盒、Identifiler?Plus試劑盒（美國(guó)AB公司）。

1.3 方法

1.3.1 樣本處理

33份骨骼用刀將骨骼內(nèi)、外表面均刮干凈，清洗后晾干，在紫外燈下照射2h。在骨密質(zhì)部位取一小塊骨片用冷凍研磨機(jī)研磨成骨粉。此外，隨機(jī)選取其中10份已清洗好的骨骼用電鉆在骨密質(zhì)部位鉆取制成骨屑（手工處理）。

15份牙齒（每份2枚）用刀片將表面刮干凈，75%乙醇溶液及去離子水分別浸泡牙齒10min，在紫外燈下照射2h。取其中一枚牙齒用冷凍研磨機(jī)研磨成牙粉。此外，隨機(jī)選取其中10份已清洗好的另一枚牙齒用牙齒粉碎器砸成粉末（手工處理）。

1.3.2 樣本量與消化時(shí)間的最優(yōu)化

隨機(jī)選取用冷凍研磨機(jī)研磨的骨粉及牙粉樣本共10份（骨粉6份，牙粉4份），根據(jù)不同的樣本量（50、100、150mg）及消化時(shí)間（2、18h）將每份樣本分成6組。根據(jù)所得DNA含量選擇最佳樣本量及消化時(shí)間。

1.3.3 AutoMate ExpressTM自動(dòng)化法醫(yī)DNA提取系統(tǒng)提取方法

取骨粉或牙粉置于管中，加入PrepFiler Express BTATM法醫(yī)DNA提取試劑盒中提供的裂解緩沖液300μL、蛋白酶 K 15μL及 DTT 15μL，在 56℃恒溫混勻儀上以離心半徑5 cm，1 100 r/min，消化2 h（或18h）后，依照PrepFiler Express BTATM法醫(yī)提取DNA試劑盒操作說明書在AutoMate ExpressTM自動(dòng)化法醫(yī)DNA提取系統(tǒng)選擇BTA程序提取DNA，DNA模板終體系為50μL。

1.3.4 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測(cè)

采用Identifiler?Plus試劑盒在9700擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為10μL，其中反應(yīng)液4μL，引物2μL，DNA 4μL。擴(kuò)增條件為 95℃ 11min；94℃ 20s，59℃ 3min，59℃ 3min，30 個(gè)循環(huán)；60℃ 30min。 PCR產(chǎn)物用3130XL遺傳分析儀電泳檢測(cè)，GeneMapper ID-X軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分型。

2 結(jié) 果

2.1 不同樣本量不同消化時(shí)間下所得DNA質(zhì)量濃度的比較

表1顯示，消化時(shí)間對(duì)DNA質(zhì)量濃度的影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而樣本量為50mg的檢材得到的DNA質(zhì)量濃度明顯低于樣本量為100 mg與150 mg的檢材（P＜0.05）。雖然樣本量為100 mg與150mg的檢材得到的DNA質(zhì)量濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但從STR分型效果來看，樣本量為150mg的檢材其RFU值及峰值均衡性均優(yōu)于樣本量為100mg的檢材。經(jīng)過對(duì)樣本量及消化時(shí)間的綜合比較，本方法采用樣本量為150mg及消化時(shí)間為2h來提取所有的骨骼及牙齒樣本。

表1 不同樣本量及不同消化時(shí)間得到的DNA質(zhì)量濃度比較（n=10，±s，ng/μL）

表1 不同樣本量及不同消化時(shí)間得到的DNA質(zhì)量濃度比較（n=10，±s，ng/μL）

注：1）與 50mg樣本量相比，P＜0.05

消化時(shí)間 50mg 100mg 150mg 2h 0.0203±0.0183 0.0405±0.02781） 0.0407±0.03221）18h 0.0252±0.0203 0.0459±0.02981） 0.0662±0.04651）

2.2 冷凍研磨機(jī)研磨樣本的DNA質(zhì)量濃度及STR分型結(jié)果

經(jīng)冷凍研磨機(jī)研磨的33份骨骼及15份牙齒樣本采用AutoMate ExpressTM自動(dòng)化法醫(yī)DNA提取系統(tǒng)提取的DNA質(zhì)量濃度及STR分型結(jié)果見表2。33份骨骼中有2份比較新鮮的樣本得到的DNA質(zhì)量濃度很高（分別為 21.93、26.20 ng/μL），15 份牙齒樣本中也有2份比較新鮮的磨牙得到的DNA質(zhì)量濃度非常高（分別為 10.18、30.98ng/μL）。 其余的樣本中，牙齒樣本得到的DNA質(zhì)量濃度普遍比骨骼樣本的高。骨骼及牙齒樣本均獲得了較好的STR分型結(jié)果（圖1～2）。

表2 骨骼及牙齒樣本DNA質(zhì)量濃度及STR分型結(jié)果

圖1 牙齒樣本的STR分型

圖2 骨骼樣本的STR分型

2.3 冷凍研磨處理樣本與手工處理樣本所得DNA質(zhì)量濃度的比較

取冷凍研磨法和手工處理法處理后的各10份骨骼及牙齒樣本，均采用AutoMate ExpressTM自動(dòng)化法醫(yī)DNA提取系統(tǒng)提取DNA，所得DNA平均質(zhì)量濃度見表3。骨骼樣本采用液氮冷凍研磨處理提取得到的DNA平均質(zhì)量濃度與手工處理相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。牙齒樣本采用液氮冷凍研磨處理所得DNA平均質(zhì)量濃度高于手工處理組（P＜0.05）。

表3 兩種方法處理樣本的DNA質(zhì)量濃度比較（n=5，±s，ng/μL）

表3 兩種方法處理樣本的DNA質(zhì)量濃度比較（n=5，±s，ng/μL）

注：1）與手工處理法相比，P＜0.05

樣本 手工 液氮冷凍研磨骨骼 0.0400±0.0250 0.0600±0.0510牙齒 0.6125±1.2215 0.8118±1.36771）

2.4 案例應(yīng)用

本實(shí)驗(yàn)室曾在2008年12月對(duì)1例清代遺骸（約150年以上）進(jìn)行DNA檢驗(yàn)，Y-STR分型與后代完全一致[4]。而常染色體則只在9個(gè)小片段基因座獲得了STR分型，其RFU值最高只有160。2012年對(duì)保存3年多的該骨骼骨粉采用本研究建立的方法進(jìn)行重新檢驗(yàn)，使用Identifiler?Plus試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，獲得13個(gè)基因座的STR分型，只有3個(gè)大片段基因座未檢出，其RFU值也上升到500左右。通過Minifiler試劑盒擴(kuò)增后將16個(gè)基因座全部補(bǔ)充完整（圖3～4）。

圖3 2012年自動(dòng)化提取獲得的STR分型

圖4 Minifiler試劑盒擴(kuò)增獲得的STR分型

3 討 論

骨骼及牙齒中DNA含量低，又有堅(jiān)硬的細(xì)胞外基質(zhì)保護(hù)，使得此類檢材的檢驗(yàn)難度較大。檢驗(yàn)步驟復(fù)雜繁瑣、易污染、檢出成功率低、取材量大、耗時(shí)長(zhǎng)等問題一直以來都無法得到有效解決。

本研究采用AutoMate ExpressTM自動(dòng)化法醫(yī)DNA提取系統(tǒng)及PrepFiler Express BTATM法醫(yī)DNA提取試劑盒相結(jié)合的方法實(shí)現(xiàn)了骨骼及牙齒高效、快捷的自動(dòng)化DNA提取。其成功率（骨骼93.9%、牙齒93.3%）與文獻(xiàn)[2]報(bào)道的磁珠法提取成功率（骨骼95.5%）相近。本研究方法具有以下幾個(gè)明顯優(yōu)勢(shì)：（1）取材量極少，僅需150mg，是手工提取所需樣本量的1/10～1/8，有效解決了部分傳統(tǒng)磁珠法提取無法復(fù)核的困境；（2）DNA 質(zhì)量高，PrepFiler Express BTATM法醫(yī) DNA提取試劑盒中提供的特殊構(gòu)造的納米級(jí)磁珠使得單位體積內(nèi)的磁珠可以有更大的表面積來吸附DNA，且其所獲得的DNA純度也極高[5]；（3）提取時(shí)間短，該方法提取骨骼及牙齒DNA僅需要56℃消化2h及自動(dòng)化提取DNA 30min即可完成；（4）免脫鈣，該方法不需EDTA脫鈣，將繁瑣、反復(fù)、長(zhǎng)時(shí)間的脫鈣步驟取消，不僅大大縮短了提取時(shí)間，也使該類檢材的污染機(jī)會(huì)大大降低；（5）實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，與常量及脫落細(xì)胞類生物檢材一樣可以在同一平臺(tái)進(jìn)行DNA提取。此外，全封閉式操作環(huán)境為防污染又提供了一道保護(hù)網(wǎng)。

骨骼類樣本使用冷凍處理與手工處理所獲得的DNA質(zhì)量濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，工作中可結(jié)合實(shí)際選擇處理方法。牙齒類樣本使用冷凍研磨處理獲得的DNA質(zhì)量濃度高于手工處理樣本，可能與液氮冷凍研磨獲得的牙粉中有核細(xì)胞暴露更多有關(guān)。

因此，在具備AutoMate ExpressTM自動(dòng)化法醫(yī)DNA提取系統(tǒng)的DNA實(shí)驗(yàn)室，沒有配備液氮冷凍研磨機(jī)的情況下仍可進(jìn)行骨骼及牙齒樣本DNA的自動(dòng)化提取。但在配備有液氮冷凍研磨機(jī)的DNA實(shí)驗(yàn)室可優(yōu)先選取牙齒樣本，因?yàn)檠例X樣本的前處理簡(jiǎn)便，而且得到的DNA質(zhì)量濃度也比骨骼樣本高，更容易成功檢驗(yàn)。

[1]葉健，季安全，鄭秀芬，等.陳舊性骨骼DNA提取技術(shù)的研究[J].中國(guó)法醫(yī)學(xué)雜志，2001，16（S0）：8-11.

[2]賈東濤，韓海軍，張玉紅，等.陳舊骨骼DNA提取方法的應(yīng)用研究[J].中國(guó)法醫(yī)學(xué)雜志，2007，22（4）：260-261.

[3]苑美青，凃政，李彩霞，等.利用壓力循環(huán)儀提取骨骼DNA[J].刑事技術(shù)，2011，（4）：29-32.

[4]李佑英，高林林，朱琳，等.清代遺骸Y-STR檢驗(yàn)1例[J].中國(guó)法醫(yī)學(xué)雜志，2011，26（2）：132-133.

[5]Davis GP，King JL，Budowle B，et al.Extraction platform evaluations： A comparison of Automate ExpressTM，EZ1?Advanced XL，and Maxwell?16 Bench-top DNA extraction systems[J].Legal Medicine，2012，14（1）：36-39.