李珍華，章志量，方秀娟，李燕瓊，石陸娥

(杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310036)

酶定向進(jìn)化技術(shù)研究進(jìn)展

李珍華，章志量，方秀娟，李燕瓊，石陸娥

(杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310036)

酶定向進(jìn)化是模擬自然進(jìn)化過(guò)程、用于改造酶性質(zhì)的一種新策略.在以易錯(cuò)PCR為代表的無(wú)性進(jìn)化技術(shù)基礎(chǔ)之上，有性進(jìn)化技術(shù)的發(fā)展使酶定向進(jìn)化更接近于自然進(jìn)化過(guò)程.與此同時(shí)為解決巨大容量的突變文庫(kù)與有限的篩選技術(shù)之間的矛盾，許多新的高通量篩選方法不斷涌現(xiàn)，大大加快了酶定向進(jìn)化技術(shù)的發(fā)展.文章從構(gòu)建高質(zhì)量的突變基因文庫(kù)和選擇有效的高通量篩選方法兩方面，詳細(xì)總結(jié)了近幾年出現(xiàn)的新技術(shù)并對(duì)其應(yīng)用情況進(jìn)行介紹.

酶定向進(jìn)化；突變基因文庫(kù)；高通量篩選方法

隨著生物催化劑在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、食品、化工、環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域的廣泛使用,定向進(jìn)化技術(shù)也在不斷成熟.酶作為最主要的生物催化劑，其定向進(jìn)化技術(shù)已被用來(lái)改造更廣范圍的酶分子，六大類酶(氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂解酶、異構(gòu)酶、連接酶)分別通過(guò)定向進(jìn)化技術(shù)在性質(zhì)方面得到很大的改善，以更好地應(yīng)用到工業(yè)生產(chǎn)上[1].然而，定向進(jìn)化技術(shù)的發(fā)展，關(guān)鍵是構(gòu)建質(zhì)量高的突變基因文庫(kù)和采用有效的高通量篩選方法.本文主要就近幾年這兩方面的技術(shù)發(fā)展及應(yīng)用做一詳細(xì)介紹.

1 突變基因文庫(kù)的構(gòu)建

1.1 無(wú)性進(jìn)化技術(shù)

1.1.1 傳統(tǒng)方法及近期應(yīng)用實(shí)例

易錯(cuò)PCR(error-prone PCR)是在PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上，通過(guò)改變反應(yīng)條件，增加堿基錯(cuò)配率，從而向目的基因中引入隨機(jī)突變的一種快速、簡(jiǎn)便的無(wú)性進(jìn)化技術(shù).該技術(shù)由Leung等[2]于1989年首次設(shè)計(jì)并報(bào)道、并由Cadwell等[3]對(duì)其進(jìn)行了完善，是最早出現(xiàn)并實(shí)際應(yīng)用的構(gòu)建突變文庫(kù)的方法，在近幾年應(yīng)用仍很廣泛.通過(guò)該項(xiàng)技術(shù)，很多酶分子的性質(zhì)得到了提高.如Trevizano等[4]利用易錯(cuò)PCR技術(shù)對(duì)來(lái)源于Orpinomycesstrain PC-2的內(nèi)-β-1,4-木聚糖酶進(jìn)行改造，以提高熱穩(wěn)定性.實(shí)驗(yàn)最終獲得4株突變體M1, M2, M3和M4，60 ℃時(shí)的半衰期分別為209, 33.2, 401 和 15.3 min，而野生型在60 ℃的半衰期僅為7.92 min，此外，M3 和 M4在極端pH環(huán)境下也具有很好的穩(wěn)定性.Yu等[5]采用該技術(shù)對(duì)在幾丁質(zhì)的生物治療方面有重要作用的內(nèi)切幾丁質(zhì)酶進(jìn)行了成功的改造，實(shí)驗(yàn)獲得的突變株MECH-Y185/S226對(duì)4-硝基苯基-N-乙酰基-β-d-氨基葡萄糖苷的催化活性提高了1.8倍，對(duì)膠體幾丁質(zhì)的催化活性提高了3.5倍，同時(shí)純化的Ech42-Y185/S226具有了更高的熱穩(wěn)定性和更廣的pH穩(wěn)定性.

1.1.2 新方法

隨著易錯(cuò)PCR技術(shù)的廣泛應(yīng)用，新的無(wú)性進(jìn)化技術(shù)也在不斷涌現(xiàn).

Wong等[6]于2004年首次提出序列飽和突變法(SeSaM)，這是一種針對(duì)單鏈DNA進(jìn)行突變的新技術(shù)，基本原理是在PCR擴(kuò)增中，通過(guò)dNTP與事先借助單鏈DNA在全長(zhǎng)基因中添加的通用次黃嘌呤脫氧核糖核苷酸(I)的交換達(dá)到突變目的.此方法與易錯(cuò)PCR相比，能較好地克服DNA聚合酶的堿基偏愛(ài)性，且突變效率高，缺點(diǎn)是操作較繁瑣、試驗(yàn)周期長(zhǎng)、使用藥品多、費(fèi)用較貴[7].

Jones[8]于2005年首次提出三核苷酸突變法(TriNex)，這是一種不依賴PCR的新技術(shù)，基本原理是首先利用轉(zhuǎn)座子MuDel的隨機(jī)插入切除原始目的基因的三核苷酸，再用連接酶把SubSeqNNN(DNA盒)插入到切除位置，引入新的三核苷酸，達(dá)到構(gòu)建突變文庫(kù)的目的.據(jù)Baldwin等[9]報(bào)道，該技術(shù)已在成功編碼TEM-1β-內(nèi)酰胺酶的bla基因中得到證實(shí)，并呈現(xiàn)了明顯的優(yōu)勢(shì)，與易錯(cuò)PCR相比，克服了其堿基偏愛(ài)性和突變文庫(kù)大、難篩選的缺點(diǎn)，而且由于它基于三核苷酸刪除與替代的原理，最終也不會(huì)造成目的基因的移碼。

Reetz等[10]于2007首次提出迭代飽和突變(ISM)，該方法結(jié)合了理性設(shè)計(jì)與隨機(jī)突變，以蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，依據(jù)待提高的酶學(xué)活性，選擇關(guān)鍵的突變點(diǎn)或區(qū)域，進(jìn)行反復(fù)飽和突變，最終篩選出目的突變株.在實(shí)際應(yīng)用中已被證實(shí)比傳統(tǒng)的易錯(cuò)PCR、在活性位點(diǎn)處的飽和突變或DNA改組方法更有效[11]，并被用來(lái)提高脂肪酶的立體選擇性和熱穩(wěn)定性[12-14]或者蛋白質(zhì)配體的特異性[15].

1.2 有性進(jìn)化技術(shù)

1.2.1 傳統(tǒng)方法及近期應(yīng)用實(shí)例

DNA改組(DNA shuffling)與基因家族改組(DNA Family shuffling)是用重組的方法將2種以上同源正突變基因序列(或天然存在的基因家族)重新排布而引起基因突變的有性進(jìn)化技術(shù)，由Stemmer等[16-17]首次提出并成功運(yùn)用.而Zhao等基于以上原理提出了改進(jìn)方法，即交錯(cuò)延伸重組(Staggered Extension Process, StEP)[18]和隨機(jī)引物體外重組(Random-priminginvitrorecombination,RPR)[19]技術(shù).對(duì)于易錯(cuò)PCR，有性進(jìn)化技術(shù)可以說(shuō)是一次成功的飛躍，能將兩個(gè)或多個(gè)父本基因的優(yōu)良性狀加以組合，從而構(gòu)建出更多樣性的突變文庫(kù)，在實(shí)際應(yīng)用中常與易錯(cuò)PCR技術(shù)結(jié)合使用.例如，為了提高根霉菌脂肪酶的性質(zhì)，Niu等[20]同時(shí)采用易錯(cuò)PCR和DNA shuffling技術(shù)對(duì)脂肪酶進(jìn)行突變，最終篩選得到的突變株與野生株相比，最適溫度提高了10 ℃，在50 ℃時(shí)的半衰期提高了12倍.對(duì)其突變氨基酸進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)第190位纈氨酸替代谷氨酸是導(dǎo)致該脂肪酶最適溫度和熱穩(wěn)定性提高的一個(gè)關(guān)鍵因素.

1.2.2 新方法

同源改組是一類只能對(duì)同源性較高的序列進(jìn)行重組的技術(shù).傳統(tǒng)有性進(jìn)化技術(shù)均屬于這一類，在此思想基礎(chǔ)上，近些年一些新的技術(shù)層出不窮.

臨時(shí)模板隨機(jī)嵌合技術(shù)(RACHITT)[21]是將隨機(jī)切割的基因片段與臨時(shí)模板(另一種或?qū)俚挠H本基因)雜交，在退火延伸階段引入錯(cuò)配或疊交，最終形成嵌合基因.用該方法得到的嵌合體文庫(kù)，平均每個(gè)基因含有14個(gè)交叉，重組效率比目前其它重組方法高出幾倍.

隨機(jī)片段交換法(RAISE)是Fujii等[22]于2006年首次提出的.該方法操作簡(jiǎn)便，僅由3步組成，即DNA破碎、添加隨機(jī)短序列和重組.由于突變片段長(zhǎng)度可以從1個(gè)變化到多個(gè)氨基酸，所以與傳統(tǒng)突變方法相比，其最大的優(yōu)勢(shì)在于增強(qiáng)了突變文庫(kù)的多樣性，如堿基插入、缺失、替換等.

單鏈DNA介導(dǎo)的家族改組是Kikuchi等[23]建立的，并應(yīng)用單鏈模板成功對(duì)家族基因nahH和xylE進(jìn)行了重組，解決了雙鏈DNA家族改組中同質(zhì)雙鏈高概率形成的問(wèn)題.實(shí)驗(yàn)中，Kikuchi等首先用傳統(tǒng)DNA家族改組中的DNaseI酶切，發(fā)現(xiàn)nahH和xylE的重組效率不到1%,而改用單鏈DNA家族改組中的限制酶切，并以單鏈DNA作為模板，nahH和xylE的重組效率接近100%.由此看出，單鏈DNA家族改組可以顯著促進(jìn)基因嵌合體的形成,效率更高，潛力更大.

與同源改組相對(duì)，非同源重組則可以在一些同源性較低的序列間進(jìn)行重組.如Ostermeier等[24]提出的漸增切割法產(chǎn)生雜合酶(SCRATCHY)技術(shù)，其基本原理是用核酸外切酶III 代替DNaseI對(duì)靶序列進(jìn)行切割，由于其5’- 3’ 外切核酸酶的作用，因此得到的遞增截短片段庫(kù)理論上包括了靶序列DNA單堿基對(duì)刪除的各種情況, 使得在較低的復(fù)性溫度下,可實(shí)現(xiàn)非同源區(qū)的融合[25].該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是可以在無(wú)同源性或低同源性的兩個(gè)基因間產(chǎn)生重組，缺點(diǎn)是重組一定是在兩個(gè)不同的父本之間產(chǎn)生，并且子代中功能雜合子的比率很低[26].

2 高通量篩選方法

構(gòu)建突變基因文庫(kù)的方法目前已經(jīng)很多,但是定向進(jìn)化成功與否的另一個(gè)關(guān)鍵因素是采用高通量的篩選方法,也就是根據(jù)突變酶的某種特征或固有性質(zhì)，控制實(shí)驗(yàn)條件，從構(gòu)建好的突變文庫(kù)中篩選出目標(biāo)酶.以下簡(jiǎn)單介紹3種常用的篩選方法：平板篩選、熒光篩選、表面展示技術(shù).

2.1 平板篩選

平板篩選主要是依據(jù)細(xì)胞的表型，將含有隨機(jī)突變基因的重組細(xì)胞從平板培養(yǎng)基上篩選出來(lái).該方法簡(jiǎn)便、快速、直觀，得到了廣泛的應(yīng)用.根據(jù)細(xì)胞表型的多樣性，可以從多個(gè)方面篩選突變基因：例如逐步改變重組細(xì)胞生長(zhǎng)的環(huán)境，依據(jù)細(xì)胞的耐受情況，可以篩選出一些對(duì)熱、pH、抗生素、極端環(huán)境等耐受性提高的突變酶；也可以將突變酶作用的底物加入平板培養(yǎng)基中，依據(jù)最終形成的透明圈的大小來(lái)篩選活力提高的酶，或者利用營(yíng)養(yǎng)缺陷株作為宿主菌，根據(jù)菌株的生長(zhǎng)情況對(duì)突變酶進(jìn)行篩選；此外，通過(guò)顏色的變化排除無(wú)效重組細(xì)胞，也可以篩選高活力的突變酶.pH指示劑法即是一例，它經(jīng)常用于檢測(cè)酯酶，以酚紅為指示劑，隨著酶催化酯類水解產(chǎn)生酸，通過(guò)體系中pH改變導(dǎo)致的顏色變化，就可以初步測(cè)定酶的活性[27].

2.2 熒光篩選

經(jīng)典的熒光篩選大多是結(jié)合酶的熒光底物或產(chǎn)物，有時(shí)也用一種熒光物質(zhì)作為指示劑或報(bào)告物質(zhì)，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，通過(guò)熒光強(qiáng)度的變化鑒定酶的活性.這種方法經(jīng)常結(jié)合微孔板(如96孔或384孔)進(jìn)行，存在一些不足，如過(guò)分依賴人力、篩選通量較低[20]等，這就限制了新酶定向進(jìn)化研究的進(jìn)展.

令人欣慰的是，近年來(lái)隨著人們對(duì)流式細(xì)胞儀的了解及廣泛應(yīng)用，基于它快速、高通量的篩選特點(diǎn)，一些新的熒光篩選方法正應(yīng)運(yùn)而生.如熒光激活細(xì)胞分選(FACS)[28]，首先將酶活性轉(zhuǎn)化為可檢測(cè)的熒光信號(hào)，并與酶所在的細(xì)胞構(gòu)建聯(lián)系，從而實(shí)現(xiàn)酶活性與細(xì)胞熒光強(qiáng)度的偶聯(lián).然后利用流式細(xì)胞儀監(jiān)測(cè)熒光強(qiáng)度信號(hào)變化，并通過(guò)給目標(biāo)細(xì)胞加上對(duì)應(yīng)的電荷，對(duì)不同的酶進(jìn)行分選收集.2010年，Yang等[29]提出了基于FACS的高通量篩選方法，成功定向改造了唾液酸轉(zhuǎn)移酶.

2.3 表面展示

表面展示技術(shù)也是近年發(fā)展起來(lái)的一類高通量的篩選技術(shù)，主要包括噬菌體表面展示技術(shù)、細(xì)菌細(xì)胞表面展示技術(shù)、酵母表面展示技術(shù)、核糖體表面展示技術(shù)等.基本原理是利用DNA重組技術(shù)，將目標(biāo)蛋白質(zhì)富集在噬菌體、細(xì)胞、核糖體等表面，其應(yīng)用主要體現(xiàn)在篩選蛋白與蛋白間的相互作用[30].在酶定向進(jìn)化方面，Love等[31]用噬菌體展示的篩選方法對(duì)大腸桿菌糖基轉(zhuǎn)移酶成功進(jìn)行了改造；Yamada等[32]將3種纖維素酶(CBH，EG，BGL)展示在釀酒酵母細(xì)胞表面，在用包含PASC(phosphoric acid swollen cellulose)的微孔板對(duì)酵母株篩選時(shí)，與單一酶降解相比，展示在釀酒酵母細(xì)胞表面3種纖維素酶對(duì)PASC的降解提高了7倍.

3 結(jié)論與展望

定向進(jìn)化技術(shù)已經(jīng)成為改造酶性質(zhì)的重要手段，近年來(lái)，酶的眾多性質(zhì)(如熱穩(wěn)定性、底物特異性、有機(jī)溶劑耐受性、立體選擇性等)被成功改造，證實(shí)了定向進(jìn)化技術(shù)的成熟與快速發(fā)展.一個(gè)定向進(jìn)化實(shí)驗(yàn)主要包括構(gòu)建高質(zhì)量的突變文庫(kù)和選擇高通量的篩選方法，這兩方面的發(fā)展是限制酶改造及新酶發(fā)現(xiàn)的瓶頸.易錯(cuò)PCR、DNA shuffling作為傳統(tǒng)的基因突變方法仍得到廣泛應(yīng)用，而新的技術(shù)方法如ISM、RAISE等也為突變基因文庫(kù)的構(gòu)建增添了新的內(nèi)容.在突變文庫(kù)篩選方面，F(xiàn)ACS發(fā)展最為迅速，它結(jié)合流式細(xì)胞儀快速、高通量的特點(diǎn)，大大改善了傳統(tǒng)篩選人力依賴重、低通量的境況，為更多新酶的篩選帶來(lái)了快捷.隨著人們的努力，相信在不斷的實(shí)驗(yàn)探索中，更多更好的定向進(jìn)化技術(shù)還會(huì)不斷涌現(xiàn).

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AdvancesinEnzymeDirectedEvolutionTechnology

LI Zhenhua, ZHANG Zhiliang, FANG Xiujuan, LI Yanqiong, SHI Lue

(College of Life and Environmental Sciences, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036, China)

Directed evolution of enzyme is widely used to change the characteristics of enzyme, which mainly mimics the progress of natural evolution. Based on the neuter evolution technology represented as error-prone PCR, the development of sexual evolution technology makes directed evolution of enzyme is closer to natural evolution. At the same time, in order to deal with the contradictions between mutant libraries and limited screening methods, a series of high-throughput screening methods appears, so that the development of enzyme directed evolution is promoted. This essay mainly summarized some recent new methods and applications about mutant gene libraries and high-throughput screening methods.

enzyme directed evolution; mutant gene library; high-throughput screening method

2013-03-20

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31100583)；浙江省錢江人才計(jì)劃項(xiàng)目(2012R10060).

石陸娥(1979—),女，副教授，博士，主要從事酶的固定化及修飾、生化分離等方面的研究.E-mail：shilue@126.com

10.3969/j.issn.1674-232X.2013.06.014

Q78

A

1674-232X(2013)06-0550-05