李素貞 陳景堂

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院 國(guó)家玉米改良中心河北分中心，保定 071001）

鋅和鐵是生物體所必需的微量元素，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過程中有著重要作用［1］。鋅是生物體300多種酶和重要蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)輔助因子［2］。鋅不僅參與機(jī)體的各種代謝，在生物膜穩(wěn)定和基因表達(dá)調(diào)控等生理機(jī)能中也擔(dān)負(fù)著重要的角色［3］。適量增加植物體內(nèi)鋅的含量可提高作物產(chǎn)量，而鋅的缺乏會(huì)導(dǎo)致葉綠素、脂質(zhì)、蛋白、質(zhì)膜的氧化破壞。植物體內(nèi)鋅離子的過度積累又會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生毒害。

鐵在細(xì)胞呼吸、光合作用和金屬蛋白的催化反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用，是重要的電子傳遞體。因此，鐵元素在原核和真核生物的生命活動(dòng)中具有不可替代的功能。另外，細(xì)胞內(nèi)過高的Fe3+/Fe2+氧化還原勢(shì)會(huì)導(dǎo)致超氧化合物的產(chǎn)生，對(duì)細(xì)胞造成傷害［4］。因此，嚴(yán)格控制植物體內(nèi)金屬離子的平衡是至關(guān)重要的，這依賴于各種轉(zhuǎn)運(yùn)體的協(xié)同作用，包括鋅、鐵轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白家族（Zinc-regulated transporters，Ironregulated transporter-like proteins，ZIP）、自然抗性相關(guān)巨噬蛋白家族（The natural resistance associated macrophage protein，NRAMP）、陽(yáng)離子擴(kuò)散輔助蛋白家族（Cation diffusion facilitator proteins，CDF）、植物重金屬ATP酶家族P1B-ATPase（Heavy metal ATPases，HMA）、黃色條紋蛋白家族（yellow stripe-like，YSL）和三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ATP-binding cassette transporter）。這些運(yùn)輸?shù)鞍讓?duì)于植物鋅鐵吸收、體內(nèi)分配以及維持細(xì)胞內(nèi)鋅鐵離子的平衡具有重要作用［5，6］。

1 參與鋅鐵吸收的蛋白

參與鋅鐵吸收的蛋白主要有3類，都是以蛋白家族形式存在的.包括ZIP即鋅調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體（Zincregulated transporter，ZRT）和鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體（Ironregulated transporter，IRT），黃色條紋蛋白家族家族（yellow stripe-like）和自然抗性相關(guān)巨噬蛋白家族（NRAMP）等蛋白定位于質(zhì)膜上，其主要參與重金屬離子從質(zhì)外體或細(xì)胞器中轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)的過程［5］。

1.1 ZIP蛋白家族

ZIP即鋅調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體（Zinc-regulated transporter，ZRT）和鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體（Iron-regulated transporter，IRT）。酵母功能互補(bǔ)試驗(yàn)顯示ZIP家族基因能夠轉(zhuǎn)運(yùn)包括Zn2+、Fe2+、Cu2+、Cd2+在內(nèi)的多種金屬離子［7］。ZIP一般由309-476個(gè)氨基酸殘基組成，有8個(gè)潛在的跨膜結(jié)構(gòu)域和相似的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，第3和第4跨膜區(qū)之間有一長(zhǎng)的可變區(qū)，可變區(qū)位于胞內(nèi)，其C、N-末端位于胞外，該區(qū)富含組氨酸殘基，可能與金屬的結(jié)合、轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)［7］。

目前在擬南芥、水稻、蒺藜苜蓿、大豆、野生型二粒小麥、葡萄等植物中鑒定出ZIP基因并對(duì)其功能進(jìn)行了研究。在擬南芥中發(fā)現(xiàn)16個(gè)ZIP家族基因，AtIRT1是通過酵母互補(bǔ)試驗(yàn)分離得到的第一個(gè)ZIP功能基因，其主要在根部表達(dá)，且該基因的過表達(dá)可導(dǎo)致鎳的過度積累［8-12］。AtIRT2主要在根部表達(dá)，定位在囊泡，推測(cè)具有細(xì)胞內(nèi)過量金屬元素的解毒功能［13，14］。AtIRT3能互補(bǔ)鋅、鐵轉(zhuǎn)運(yùn)雙突變體，過表達(dá)AtIRT3會(huì)使鋅在地上部、鐵在地下部積累［15］。表達(dá)分析顯示，AtZIP1、AtZIP5、AtZIP9、AtZIP12和AtIRT3受缺鋅誘導(dǎo)，由此可推測(cè)，這些基因在缺鋅條件下可能增強(qiáng)鋅的吸收能力［16］。

ZIP家族基因在水稻中也有研究報(bào)道［17-22］，OsIRT1為鐵轉(zhuǎn)運(yùn)體，在缺鐵條件下負(fù)責(zé)從土壤中吸收鐵［11］，其過表達(dá)可使地上部、地下部和成熟種子中的鋅鐵含量提高［22］。OsZIP1和OsZIP3受缺鋅誘導(dǎo)于地上部和地下部中表達(dá)量升高，而OsZIP2主要在地下部表達(dá)升高［17］。原位雜交試驗(yàn)顯示OsZIP1和OsZIP3主要在根和莖的維管束和根部韌皮部細(xì)胞中表達(dá)［17］，而OsZIP4則主要在韌皮部和分生組織表達(dá)［18］。過表達(dá)OsZIP5或OsZIP8會(huì)使水稻地上部的鋅含量降低，而地下部中鋅過量積累［20，21］。

野生二粒小麥中克隆的TdZIP1為缺鋅誘導(dǎo)的鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體，其定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，過表達(dá)TdZIP1導(dǎo)致鋅在細(xì)胞內(nèi)的積累產(chǎn)生細(xì)胞毒性［23］。Northern分析發(fā)現(xiàn)GmZIP1在缺鋅23 d的大豆根、莖和葉中不表達(dá)，但在缺鋅大豆的根瘤中表達(dá)，且隨著缺失天數(shù)增加至35 d時(shí)，表達(dá)量達(dá)到最高，推測(cè)GmZIP1可能在植株與根瘤菌的共生中發(fā)揮作用［24］。在模式豆科植物蒺藜苜蓿中MtZIP1、MtZIP5和MtZIP6互補(bǔ)鋅缺陷酵母突變株，MtZIP4和MtZIP7互補(bǔ)錳缺陷酵母突變株，而MtZIP3、MtZIP5和MtZIP6互補(bǔ)鐵缺陷酵母突變株［25］，說明ZIP家族基因具有一定的金屬元素選擇性。ZmZLP1是從玉米花粉cDNA文庫(kù)中分離得到的ZIP-like家族基因，其編碼蛋白定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，可能負(fù)責(zé)鋅從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，參與未折疊蛋白反應(yīng)，并且提高酵母細(xì)胞的耐熱性［26］。

1.2 YSL蛋白家族

ZmYSL1是最早從缺鐵脅迫玉米根系cDNA文庫(kù)中分離得到的基因，它是多肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的一個(gè)成員，能夠轉(zhuǎn)運(yùn)麥根酸類物質(zhì)［Muginetic acids，Mas與鐵離子螯合物（Mas-Fe3+）的功能］，其酵母互補(bǔ)試驗(yàn)也證明了YSL1的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)載體功能［27，28］。從玉米中共預(yù)測(cè)出15個(gè)YSL基因，跨膜結(jié)構(gòu)域6-17個(gè)，編碼序列891-2 088 bp。另有研究表明ZmYSL1定位在側(cè)根和根冠的表皮細(xì)胞及葉肉細(xì)胞，主要參與鐵及其他多種金屬離子的吸收與胞內(nèi)運(yùn)輸［29］。玉米YSL1突變體由于不能轉(zhuǎn)運(yùn)Fe3+-植物載體復(fù)合物（PS）而使玉米葉脈間失綠，呈現(xiàn)黃色條紋狀，因此被命名為yellow stripe（YS）［30］。水稻基因組中具有15個(gè)YSL成員，在缺鐵條件下OsYSL2在葉片中的表達(dá)量升高，且證明OsYSL2可轉(zhuǎn)運(yùn)尼克煙酰胺（NA）-Fe和NA-Mn螯合物。這些結(jié)果表明，OsYSL2負(fù)責(zé)NA-Fe和NA-Mn在韌皮部的運(yùn)輸，并且具有將鐵和錳轉(zhuǎn)運(yùn)至籽粒中的作用［31］。OsYSL16則在維管束MA-Fe3+的分配中起重要作用［32］。

AtYSL1、AtYSL2和AtYSL3是擬南芥中的YSL家族成員。AtYSL1基因特異存在于幼芽和花粉中，高鐵條件下，AtYSL1在幼芽中的轉(zhuǎn)錄水平會(huì)增高。ysl1突變體地上部積累大量NA，而種子中的鐵和NA含量明顯比野生型的含量低［33］。這些結(jié)果表明，AtYSL1可能具有將鐵從莖和葉轉(zhuǎn)移至種子中的作用［33］。此外，AtYSL2轉(zhuǎn)運(yùn)NA-Fe和NA-Cu螯合物，在根部和地上部都有表達(dá)，并且AtYSL2的轉(zhuǎn)錄水平受鐵和銅的調(diào)節(jié)，表明AtYSL2可能參與金屬離子在維管束中的橫向運(yùn)輸［5，34］。AtYSL3可能在維管束細(xì)胞中起到轉(zhuǎn)運(yùn)金屬-NA復(fù)合物的作用［35］。HvYSL5主要在大麥的根中表達(dá)（成熟根區(qū)表達(dá)，根尖不表達(dá)），并且受缺鐵誘導(dǎo)，時(shí)空表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)HvYSL5呈現(xiàn)出晝夜節(jié)律，基因敲除后植物沒有表現(xiàn)出明顯的表型，推測(cè)HvYSL5可能具有瞬時(shí)儲(chǔ)存鐵或者植物鐵載體的功能［36］。

1.3 NRAMP蛋白家族

自然抗性巨噬蛋白（NRAMP）主要參與多種二價(jià)金屬陽(yáng)離子的轉(zhuǎn)運(yùn)，如Zn2+、Fe2+、Cu2+、Mn2+等［37］。NRAMP家族基因編碼多肽分子，其氨基酸序列具有高度的同源性和相似的二級(jí)結(jié)構(gòu)，包括10-12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，1-2個(gè)糖基化的胞質(zhì)外環(huán)狀結(jié)構(gòu)和一個(gè)胞質(zhì)內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)域［5，38］。

在擬南芥中和水稻中分別克隆了5個(gè)AtNRAMP基因和3個(gè)OsNRAMP基因，AtNRAMP1、3、4與水稻OsNRAMP1和OsNRAMP3屬于一類。AtNRAMP2-5和水稻OsNRAMP2代表另一類蛋白［39］。AtNRAMP1、2在根和芽中表達(dá)，過表達(dá)AtNRAMP1的番茄對(duì)鐵脅迫的耐受力增強(qiáng)［40］。另有研究表明，AtNRAMP3和AtNRAMP4定位到液泡膜上，負(fù)責(zé)將Fe2+從液泡運(yùn)到胞質(zhì)，其轉(zhuǎn)錄水平受到細(xì)胞內(nèi)鐵離子濃度的調(diào)節(jié)。低鐵條件下，nramp3和nramp4導(dǎo)致種子萌發(fā)晚于野生型，AtNRAMP1、3、4能互補(bǔ)酵母缺陷型雙突變株對(duì)錳或鐵的吸收功能。AtNRAMP3和AtNRAMP4能夠提高酵母對(duì)鎘的敏感性，并導(dǎo)致鎘的積累。該結(jié)果表明AtNRAMP編碼多種底物特異性的金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白［41，42］。在水稻中，微陣列分析發(fā)現(xiàn)OsNRAMP1在缺鐵條件下表達(dá)上調(diào)，OsNRAMP1蛋白定位在質(zhì)膜上，可轉(zhuǎn)運(yùn)Fe和Cd，主要在根中表達(dá)，參與細(xì)胞中鎘的吸收與積累［43］。OsNRAMP2主要在葉中表達(dá)，OsNRAMP3在所有組織都表達(dá)。Sperotto等［44］發(fā)現(xiàn)，OsNRAMP7和OsNRAMP8與水稻籽粒中鋅、鐵的濃度呈現(xiàn)出負(fù)相關(guān)性。說明這兩個(gè)基因?qū)ψ蚜Ｖ袖\、鐵離子濃度的積累不利。

2 參與鋅鐵排出的蛋白

參與鋅鐵排出的蛋白主要有3類，包括陽(yáng)離子擴(kuò)散協(xié)助家族蛋白（CDF）、P1B型ATPases、三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ATP-binding cassette transporter）具有將重金屬運(yùn)載出細(xì)胞質(zhì)或進(jìn)入特定的細(xì)胞器的功能，因此可能具有解毒功能［5，6］。

2.1 CDF蛋白家族

CDF（cation diffusion facilitator）蛋白可將胞質(zhì)內(nèi)過量的Zn2+轉(zhuǎn)運(yùn)至胞外，或區(qū)室化胞內(nèi)過量的Zn2+，以起到解毒或儲(chǔ)存的作用［45］。大部分的CDF家族成員具有6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，并有相似的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。CDF家族最保守的序列為第Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ跨膜區(qū)，具有極保守的極性或帶電氨基酸，可能與底物的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)［46］。在植物中第一個(gè)鑒定出的CDF家族成員是ZAT，后被更名為AtMTP1，其編碼蛋白定位在葉片和根部細(xì)胞的液泡膜上，可能具有將Zn2+運(yùn)載至液泡的作用［47］。過表達(dá)AtMTP1可提高植物對(duì)高鋅脅迫的耐受性，并且會(huì)提高植株根部鋅含量［48］。AtMTP3定位在液泡膜上，在zrc1cot1雙突變的芽殖酵母中能夠提高對(duì)鋅和鈷的耐受性，過表達(dá)AtMTP3可增加擬南芥根和蓮座葉中鋅的含量和提高耐受性。野生型擬南芥在高鋅、高鈷濃度且無(wú)毒害條件下，能使AtMTP3在根毛區(qū)的表皮細(xì)胞中表達(dá)增強(qiáng)。RNA干擾AtMTP3會(huì)導(dǎo)致植物細(xì)胞對(duì)高鋅脅迫比較敏感［49］。HvMTP1是大麥中的一個(gè)CDF成員，與AtMTP1高度相似，但不像AtMTP1高度選擇Zn2+，而是對(duì)Zn2+和Co2+高度親和，其定位在液泡膜上［50］。

水稻中也有CDF家族蛋白的研究，OsMTP1是一個(gè)二價(jià)陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其定位在細(xì)胞膜上，可轉(zhuǎn)移Zn2+和Cd2+以及其他重金屬離子，并且保持金屬離子的體內(nèi)平衡［51］。OZT1是在水稻中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)定位到液泡中的CDF家族蛋白，其在各種組織中均有表達(dá)，并且在高Zn2+和Cd2+脅迫條件下表達(dá)上調(diào)，OZT1在酵母中表達(dá)能夠增強(qiáng)酵母對(duì)Zn2+和Cd2+的耐受性，這些試驗(yàn)表明，OZT1能夠轉(zhuǎn)運(yùn)和保持植物體中Zn、Cd和其他重金屬的平衡［52］。

2.2 P1B型ATPases

P型ATPases超級(jí)家族包括多個(gè)重金屬ATPases（HMA），P1B型ATPases是其中的一個(gè)亞族。Zn2+、Cd2+、Pb2+和Co2+等離子利用水解ATP釋放的能量進(jìn)行跨膜運(yùn)輸。P-ATPase的合成包括一個(gè)磷酸化介導(dǎo)的酶促反應(yīng)，故稱之為P-ATPases［53］。ATPase一般含8個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，在第Ⅵ與第Ⅶ跨膜結(jié)構(gòu)域之間有一個(gè)大的胞質(zhì)環(huán)，環(huán)上有磷酸化結(jié)構(gòu)域。膜內(nèi)有Cys-pro-Cys/His/Ser基序，在金屬元素轉(zhuǎn)運(yùn)過程中起作用［1，54-56］。

在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了8個(gè)HMA成員，其中HMA1-4是二價(jià)陽(yáng)離子載體，參與Cd2+/Pb2+/Zn2+/Co2+的運(yùn)輸，HMA5-8是單價(jià)陽(yáng)離子載體，參與Ag+/Cu+的運(yùn)輸［53，57］。擬南芥中AtHMA2和AtHMA4是Zn2+和Cd2+的高親和性質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白定位在質(zhì)膜上，主要在根、莖和葉片的微管組織表達(dá)，通過向胞外排出過量的Zn2+和Cd2+，提高植物對(duì)Zn和Cd的耐受性［58］。hma2和hma4雙突變體導(dǎo)致地上部鋅的含量降低，hma4單突變使鋅的含量也比野生型低，HMA2是依賴于Zn2+的ATPase，雖然也能被Cd2+等離子所激活，但激活程度比Zn2+低，過表達(dá)AtHMA4能夠改善根在高濃度Zn2+和Cd2+條件下的生長(zhǎng)狀況，并且地上部鋅和鎘的含量增加。這些結(jié)果表明，HMA2和HMA4對(duì)于調(diào)節(jié)植物體內(nèi)鋅離子的平衡有重要作用，HMA4可能參與金屬離子咋木質(zhì)部的裝載［59-62］。在煙草中表達(dá)AtHMA4可以改變Zn和Cd在根和地上部的分配，并且增加植株對(duì)Zn和Cd的耐受性［63］。

2.3 三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白

三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包含4-6個(gè)跨膜疏水區(qū)域、ATP結(jié)合區(qū)域和核苷酸結(jié)合區(qū)域。三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白利用水解ATP釋放的能量使多種重金屬離子進(jìn)行跨膜運(yùn)輸。MRP與PDR是目前了解得最為詳細(xì)的三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞族，與重金屬的解毒有關(guān)。參與鋅鐵轉(zhuǎn)運(yùn)的三磷酸結(jié)合盒蛋白，目前在水稻中有OsPDR9，鋅和鎘可誘導(dǎo)OsPDR9在水稻幼苗的根中表達(dá)［63］在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了120個(gè)三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，但目前研究得還很少。

3 結(jié)語(yǔ)

增加糧食作物籽粒中的鋅鐵含量，對(duì)滿足人類鋅鐵營(yíng)養(yǎng)具有重要意義，研究作物籽粒富集鋅和鐵的生理機(jī)制，利用現(xiàn)代分子生物技術(shù)生物強(qiáng)化籽粒中鋅鐵的含量是增加籽粒中鋅鐵含量的一種途徑。目前，已知許多轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與了植物體內(nèi)鋅鐵離子平衡網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，一些蛋白也被應(yīng)用到植物的轉(zhuǎn)基因研究中，如在大麥中過表達(dá)AtZIP1基因能夠增加鋅和鐵在種子中的含量。同樣，過表達(dá)OsIRT1基因，水稻中鋅和鐵的含量在地上部、地下部和種子中都有所提高。但在水稻中過表達(dá)OsZIP4、OsZIP5、OsZIP8和OsZIP9，結(jié)果導(dǎo)致過量的鋅聚集于根部，降低了植株地上部分的鋅含量，沒有達(dá)到在籽粒中增加鋅含量的目的。因此，這些基因的過表達(dá)對(duì)水稻籽粒中鋅的富集不利。這些結(jié)果表明，異位過表達(dá)對(duì)于鋅鐵的積累與分布可能會(huì)起到一定的作用。然而，有關(guān)鋅鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在籽粒中的研究還很少。所以，可以先研究籽粒中某些基因的表達(dá)模式，鑒定出其中對(duì)于轉(zhuǎn)運(yùn)或儲(chǔ)藏鋅鐵起關(guān)鍵作用的基因，然后進(jìn)行過表達(dá)或者組織特異性表達(dá)這些基因，以提高籽粒中鋅鐵含量的目的。

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