牛德芳，陳 璇，胡福良

(浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，杭州 310058)

microRNAs(miRNAs)是一類長度為19～24 nt的非編碼單鏈RNA，由長度約70～90 nt 具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的單鏈RNA 前體(pre-miRNA)經(jīng)Dicer 酶加工生成。miRNAs 靶向一個或多個目標(biāo)基因的3'端非編碼區(qū)，通過抑制mRNA 翻譯或降解mRNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)(Lau et al.，2001;Kim，2005)。miRNAs 廣泛存在于動植物以及病毒中，參與細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖與凋亡、胚胎和組織分化、激素分泌、免疫應(yīng)答等過程，并與癌癥和其他疾病的發(fā)生有關(guān)(Bartel，2004;Chen et al.，2008)。

昆蟲miRNAs 的研究較少，主要集中在果蠅Drosophila melanogaster Meigen 上。研究發(fā)現(xiàn)miRNAs 參與調(diào)控果蠅的細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分裂、Notch 信號通路、神經(jīng)發(fā)育、卵子發(fā)生等生物學(xué)過程(Lai et al.，2005;Leaman et al.，2005;Nakahara et al.，2005)。隨著越來越多昆蟲全基因組測序的完成，在全基因組水平上鑒別新的miRNAs 及其功能得到了快速發(fā)展。蜜蜂Apis 作為典型的社會性昆蟲，被廣泛認(rèn)為是研究社會行為機(jī)制和進(jìn)化的模式生物(Robinson et al.，2005;鄭火青和胡福良，2009)。因此，研究蜜蜂miRNAs 的種類及其在蜜蜂個體發(fā)育、級型分化、社會性行為等方面的調(diào)控作用，對了解miRNAs 的進(jìn)化過程以及它們對昆蟲生物學(xué)功能的影響有著重要的借鑒意義。

1 蜜蜂miRNAs 全基因組水平的挖掘

1993年，Lee 等在線蟲Caenorhabditis elegans Maupas 中首次發(fā)現(xiàn)miRNA——lin-4，之后在動物、植物和病毒中發(fā)現(xiàn)了許多不同的miRNAs 基因。目前，最新 miRBase19.0 版本數(shù)據(jù)庫中(http://www.mirbase.org/)收錄的成熟miRNAs增至25141 條，共涵蓋193個物種。2006年西方蜜蜂A.mellifera 基因組測序的完成，為蜜蜂miRNAs 的識別和功能研究奠定了基礎(chǔ)。Weaver 等(2007)首先運(yùn)用3種獨(dú)立的計(jì)算方法識別了蜜蜂全基因組中65個miRNAs 候選基因，其中包括與果蠅同源或是果蠅中沒有識別的miRNAs。他們推測這些miRNAs 可能參與了蜜蜂的發(fā)育，特別是參與調(diào)控蜂王和工蜂發(fā)育途徑的轉(zhuǎn)變。

隨著深度測序技術(shù)的發(fā)展，盡可能全面地挖掘蜜蜂miRNAs 成為可能。Chen 等(2010)利用高通量測序技術(shù)挖掘蜜蜂三型蜂(蜂王、工蜂、雄蜂)不同發(fā)育階段(卵、幼蟲、蛹和成蟲)的miRNAs 及其表達(dá)情況，預(yù)測獲得了267個新的候選miRNAs(其中110個被miRBase 數(shù)據(jù)庫收錄)，81個新的miRNAs 在其他昆蟲中有直系同源基因，說明它們可能有類似的功能。該研究不僅豐富了蜜蜂miRNAs 的種類和數(shù)量，也為探索miRNAs 在蜜蜂生物學(xué)過程中的調(diào)控功能奠定了基礎(chǔ)，甚至為其他昆蟲或物種miRNAs 的識別提供參考。

2 蜜蜂miRNAs 的特異性/偏好性表達(dá)

miRNAs 的表達(dá)具有階段、組織、級型和性別差 異 性(Babak et al.，2004;Mishima et al.，2008)。例如，一些哺乳動物大腦偏好性表達(dá)的miRNAs 參與神經(jīng)元分化、突觸可塑性和行為調(diào)控等功能(Smirnova et al.，2005;Schratt et al.，2006;Wayman et al.，2008)。為了解蜜蜂miRNAs 的表達(dá)特性，Weaver 等(2007)對預(yù)測的65個miRNAs 進(jìn)行檢驗(yàn)，大部分已被證實(shí)至少在蜜蜂的一個組織中表達(dá)，其中ame-mir-9a、C3345和C5152 在工蜂腹部高表達(dá)，C1504和ame-mir-71 在蜂王腹部高表達(dá)，而ame-mir-71 在蜜蜂蛹期的表達(dá)高于成蟲期。Hori 等(2011)研究了ame-mir-276和ame-mir-1000 在成年蜜蜂腦部的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，ame-mir-276和ame-mir-1000 分別在工蜂和雄蜂大腦中以大腦-特異性和-偏好性的方式表達(dá)。特別是ame-mir-276在哺育蜂、采集蜂、蜂王和雄蜂大腦的蘑菇體的視葉和小型-Kenyon 細(xì)胞中富集表達(dá);ame-mir-1000和ame-mir-276 幾乎所有的預(yù)測靶標(biāo)都編碼神經(jīng)功能相關(guān)的基因，說明這兩個miRNAs 都參與神經(jīng)功能調(diào)節(jié)(Hori et al.，2011)。

3 蜜蜂級型分化相關(guān)miRNAs 的研究

蜜蜂作為典型的社會性昆蟲，最重要的特征就是級型分化(Michener and Brothers，1974;鄭火青等，2010)。雌性個體分化為蜂王和工蜂兩個級型，蜂王專司產(chǎn)卵，工蜂從事除產(chǎn)卵以外的巢內(nèi)外所有工作(Winston，1987;Robinson et al.，1997)。雌性蜜蜂級型分化是一個典型的表觀遺傳現(xiàn)象(Maleszka，2008;Chittka and Chittka，2010)。表觀遺傳學(xué)涉及的機(jī)制主要包括DNA 甲基化、組蛋白修飾和miRNAs(Allis et al.，2007;Chuang and Jones，2007)。因此，不難推測miRNAs 在蜜蜂級型分化中發(fā)揮了重要的作用。

Weaver 等(2007)發(fā)現(xiàn)miRNAs 在蜂王和工蜂腹部顯示出不同的表達(dá)水平，并推測與它們生殖力不同造成的腹部生理相差甚遠(yuǎn)有關(guān)系。為了探索蜜蜂級型分化關(guān)鍵時期(幼蟲階段)差異表達(dá)的miRNAs，陳璇等(2012)利用高通量測序系統(tǒng)檢測了4、5日齡蜂王幼蟲和工蜂幼蟲中表達(dá)的miRNAs，從中分別識別出92、96、91和95個已知的蜜蜂miRNAs，并預(yù)測得到35、61、74和111個新的蜜蜂miRNAs。同時預(yù)測差異表達(dá)顯著miRNAs 的靶基因發(fā)現(xiàn)，ame-mir-14、ame-mir-2796、ame-mir-34和ame-mir-317、ame-mir-375 可能分別參與調(diào)控蜂王和工蜂免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)元的發(fā)育和分化、大腦功能相關(guān)發(fā)育和分化、消化系統(tǒng)發(fā)育等過程。

4 蜜蜂行為相關(guān)的miRNAs 研究

工蜂具有與日齡相關(guān)的完整勞動分工體系，即成年蜂在幼齡時主要從事巢內(nèi)的哺育工作，到了2～3 周后，開始從事外出采集活動。研究證實(shí)這一行為的轉(zhuǎn)變與蜜蜂腦部化學(xué)物質(zhì)、腦部結(jié)構(gòu)、激素分泌和基因表達(dá)等因素有關(guān)(Robinson，2002)。miRNAs 與蜜蜂行為轉(zhuǎn)變關(guān)系的研究最先是Behura 等(2010)開展的，他們采用qRT-PCR 的方法研究了20個預(yù)測的miRNAs 基因在幼齡哺育蜂和老齡采集蜂腦部的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miRNA-124、miRNA-14、miRNA-276、miRNA-13b、let-7和miRNA-13a 在哺育蜂中高表達(dá);miRNA-12、miRNA-9、miRNA-219、miRNA-210、miRNA-263、miRNA-92和miRNA-283 在采集蜂中高表達(dá)，說明蜜蜂miRNAs 的表達(dá)不僅具有階段特異性，而且差異表達(dá)的miRNAs 可能參與了蜜蜂日齡相關(guān)的行為改變。

鑒于之前研究的大部分與蜜蜂行為相關(guān)的miRNAs 是預(yù)測序列，而不是實(shí)驗(yàn)上證實(shí)的，特別是miRNAs 前體序列形成成熟的miRNAs 還需要經(jīng)歷非常復(fù)雜的加工過程，可能與成熟miRNAs 的表達(dá)模式是不同的(Kim，2005)。Greenberg 等(2012)和Liu 等(2012)分別利用高通量測序的方法比較了內(nèi)勤蜂和采集蜂大腦中miRNAs 的表達(dá)差異。Greenberg 等(2012)獲得97個在工蜂頭部表達(dá)的miRNAs，包括17個新的miRNAs，其中，5個高表達(dá)的miRNAs 中，ame-miR-184和ame-miR-2796 在采集蜂頭部表達(dá)水平高于哺育蜂;ame-miR-1和ame-miR-275 在哺育蜂頭部表達(dá)水平高于采集蜂;Bantam 在哺育蜂和采集蜂頭部表達(dá)水平接近。研究還發(fā)現(xiàn)，在哺育蜂和采集蜂頭部表達(dá)量最高，且在大腦中的表達(dá)水平高于頭部腺體和頭部其他組織的ame-mir-2796 很可能是通過協(xié)同增強(qiáng)宿主基因(PLC)-epsilon 的作用，而參與蜜蜂神經(jīng)元的發(fā)育和分化，從而調(diào)控蜜蜂的勞動分工(Greenberg et al.，2012)。Liu 等(2012)比較哺育蜂和采集蜂頭部miRNAs 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)9個已知蜜蜂miRNAs 表達(dá)差異顯著，其中ame-miR-31a、ame-let-7、ame-miR-279和ame-miR-275 在哺育蜂的表達(dá)水平高于采集蜂，ame-miR-13b、ame-miR-133、ame-miR-210、ame-miR-278和ame-miR-92a 在采集蜂中的表達(dá)水平高于哺育蜂。此外，他們還識別出67個新的蜜蜂miRNAs。Li 等(2012)利用同樣的方法分析采集蜂和舞蹈蜂miRNAs 的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)54個已知miRNAs 在二者中共同表達(dá)，其中32個miRNAs 在舞蹈蜂中顯著下調(diào)，ame-miR-34，ame-miR-210，ame-miR-278和ame-miR-282 差異最大。此外，在采集蜂和舞蹈蜂中分別預(yù)測到86個和104個新的miRNAs。利用qRT-PCR 進(jìn)行驗(yàn)證，證實(shí)ame-miR-278和ame-miR-282 在舞蹈蜂中表達(dá)顯著下調(diào)，并且兩者對應(yīng)的靶基因與激酶、神經(jīng)功能、突觸結(jié)合蛋白和能量代謝有關(guān)(Li et al.，2012)。該研究表明，miRNAs 參與調(diào)控蜜蜂的采集和舞蹈行為，并發(fā)揮重要功能。

5 結(jié) 語

蜜蜂miRNAs 的表達(dá)具有級型、階段和組織特異性，探索這些差異或是特異性表達(dá)的miRNAs 不僅豐富了miRNAs 的種類和數(shù)量，也為探索miRNAs 在蜜蜂發(fā)育階段或是整個生命周期中的調(diào)控功能提供了基礎(chǔ)。此外，miRNAs 作為基因表達(dá)調(diào)節(jié)子在社會多樣性中起作用，識別蜜蜂行為轉(zhuǎn)變相關(guān)的miRNAs 有助于闡明社會生活相關(guān)基因的調(diào)控機(jī)制，也有利于蜜蜂在社會行為學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、行為遺傳學(xué)和免疫學(xué)等領(lǐng)域中發(fā)揮其模型作用。

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