蔣 晴，蘇宏華，楊益眾

(揚(yáng)州大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009)

自美國(guó)太平洋酵母公司1957年生產(chǎn)出第一個(gè)蘇云金桿菌 (Bacillus thuringiensis，Bt)商品制劑以來(lái)，Bt作為一種對(duì)人畜安全、無(wú)環(huán)境污染的微生物殺蟲劑，在農(nóng)林及衛(wèi)生害蟲的防治中發(fā)揮了重要作用，成為國(guó)內(nèi)外開(kāi)發(fā)應(yīng)用最成功的一種生物農(nóng)藥。70年代，比利時(shí)Montagu實(shí)驗(yàn)室首次報(bào)道將Bt－δ內(nèi)毒素轉(zhuǎn)入煙草獲得轉(zhuǎn)基因煙草，隨后相繼出現(xiàn)轉(zhuǎn)Bt西紅柿、馬鈴薯、棉花、玉米等轉(zhuǎn)基因作物。我國(guó)于1996年在河北、山東、河南等地開(kāi)始大面積種植轉(zhuǎn)Bt基因棉花 (譚聲江等，2001)。Bt生物農(nóng)藥和轉(zhuǎn)Bt基因作物的推廣使用有效地減少了化學(xué)農(nóng)藥的用量，保護(hù)了生態(tài)環(huán)境。但是，轉(zhuǎn)基因作物的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)也不容忽視，其中最主要的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)就是害蟲的抗性問(wèn)題(McGaughey，1994;Candas et al.，2003)。如同各種化學(xué)農(nóng)藥的使用一樣，害蟲在持續(xù)選擇壓力下，也會(huì)對(duì)Bt毒素產(chǎn)生抗性。McGuaghye于1985年首次報(bào)道了在實(shí)驗(yàn)室條件下印度谷螟Plodia interpunctella對(duì) Bt毒素產(chǎn)生了抗性 (Johnson，1990)，其它還有鱗翅目、鞘翅目、雙翅目等十幾種昆蟲也能對(duì) Bt毒素產(chǎn)生抗性 (Ferré and Van Rie，2002)。不過(guò)與化學(xué)殺蟲劑相比，害蟲對(duì)Bt毒素產(chǎn)生抗性的速度比較慢 (梁革梅等，2001)。

Heckel(1994)分析了昆蟲對(duì)Bt毒素產(chǎn)生抗性的10種潛在機(jī)理，歸納如下:(1)Bt毒素的溶解性:原毒素不能溶解或溶解性降低;(2)Bt原毒素的蛋白水解性:水解不充分或過(guò)度水解;(3)毒素與細(xì)胞膜上受體的結(jié)合:毒素與受體的結(jié)合由于競(jìng)爭(zhēng)性抑制而受阻、受體的一級(jí)結(jié)構(gòu)或二級(jí)結(jié)構(gòu)的修飾作用發(fā)生改變，導(dǎo)致毒素與受體的結(jié)合位點(diǎn)減少;(4)細(xì)胞膜上孔洞的形成:孔洞形成受阻或孔洞阻塞;(5)中腸上皮的修復(fù)作用;(6)行為機(jī)理等。從現(xiàn)有資料看來(lái)，細(xì)胞膜上毒素與受體結(jié)合力的改變是最熱門的研究?jī)?nèi)容，也被認(rèn)為是抗性產(chǎn)生的最主要環(huán)節(jié) (譚聲江等，2001)。如在印度谷螟中，抗性種群的中腸上皮細(xì)胞刷狀緣膜囊 (Brush border membrane vesicles，BBMV)結(jié)合力下降了50倍，導(dǎo)致毒性降低100倍以上 (van Rie et al.，1990)。Ferré和Tabashnik研究發(fā)現(xiàn)Bt毒素與BBMV結(jié)合力的下降是抗性的主要機(jī)理 (Ferré et al.，1991;Tabashnik，1994)。比較而言，害蟲取食Bt毒素后其體內(nèi)酶活性的變化與抗性之間關(guān)系的研究報(bào)道則較少。一些研究者認(rèn)為，害蟲對(duì)Bt毒素產(chǎn)生抗性有可能依賴于抗性昆蟲體內(nèi)一些酶的水平或類型的變化。中腸蛋白酶、解毒酶和保護(hù)酶是昆蟲體內(nèi)最主要的三大酶系，本文著重綜述害蟲對(duì)Bt毒素產(chǎn)生抗性與這三大酶系之間的關(guān)系。

1 中腸蛋白酶

中腸是昆蟲消化吸收食料的重要場(chǎng)所，也是Bt毒蛋白的作用部位，更是Bt毒蛋白殺蟲機(jī)理研究涉及的重要組織。昆蟲中腸蛋白酶是中腸上皮細(xì)胞分泌的能激活Bt原毒素的重要酶系，研究Bt毒蛋白對(duì)中腸蛋白酶生物化學(xué)的影響對(duì)于Bt毒素的作用方式和致病機(jī)理具有重要意義 (徐艷聆等，2006a)。國(guó)內(nèi)外已有多篇報(bào)道確認(rèn)中腸蛋白酶與抗性的產(chǎn)生密切相關(guān)，甚至認(rèn)為是抗性產(chǎn)生的主要機(jī)理。Oppert等 (1997)在研究了抗性印度谷螟中腸蛋白酶活性后發(fā)現(xiàn)，抗性的產(chǎn)生是由于酶活的降低，隨之減弱了對(duì)原毒素的活化作用，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)其酶活的降低是因?yàn)槿笔Я艘环N重要的中腸蛋白酶，而且發(fā)現(xiàn)其對(duì)原毒素抗性要比活化毒素的抗性高11倍。這表明中腸蛋白酶參與了抗性的產(chǎn)生。Candas也得出了類似的結(jié)論(Candas et al.，2003)。Liu等 (2000)研究發(fā)現(xiàn)抗性小菜蛾P(guān)ultella xylostella對(duì)CryAc原毒素的抗性比對(duì)活化CryAc毒素的抗性高2.5倍，說(shuō)明蛋白酶活化作用的降低參與了抗性的組成。Huang等(1999)研究也發(fā)現(xiàn):在歐洲玉米螟Ostrinia nubilalis中，蛋白酶活化作用的降低是一個(gè)重要的抗性機(jī)理。除了中腸蛋白酶對(duì)Bt原毒素的活化作用減弱會(huì)導(dǎo)致昆蟲對(duì)Bt毒素產(chǎn)生抗性外，中腸蛋白酶對(duì)Bt毒素降解作用的增強(qiáng)也會(huì)導(dǎo)致抗性的產(chǎn)生。Keller等 (1996)研究發(fā)現(xiàn)?；页嵋苟闟podoptera littoralis 5齡幼蟲體內(nèi)中腸蛋白酶活性升高與其對(duì)Cry1C的不敏感性有關(guān)。這可能是因?yàn)橹心c蛋白酶加快了對(duì)毒素的降解。Forcada等(1996)對(duì)抗性煙芽夜蛾Heliothis virescens的研究表明:抗性的產(chǎn)生是由于中腸蛋白酶對(duì)原毒素活化作用的下降及對(duì)活化毒素降解作用的上升。

昆蟲中腸內(nèi)的蛋白酶根據(jù)其氨基酸序列及對(duì)金屬離子的依賴性可分為絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶等。而在鱗翅目昆蟲的中腸內(nèi)主要以類胰蛋白酶、類胰凝乳蛋白酶等絲氨酸蛋白酶為主。另外類胰蛋白酶又可進(jìn)一步分為強(qiáng)堿性類胰蛋白酶和弱堿性類胰蛋白酶 (Applebaum，1985;王琛柱和欽俊德，1996)。到底是哪種酶在起主導(dǎo)作用結(jié)論不一。邵宗澤研究表明，類胰凝乳蛋白酶在降解Bt毒素的過(guò)程中起著主導(dǎo)作用 (邵宗澤和喻子牛，1999);Zhu等研究發(fā)現(xiàn)，印度谷螟對(duì)Bt毒素抗、感種群體內(nèi)類胰凝乳蛋白酶的含量有差異:抗性種群比敏感種群低了近3倍 (Zhu et al.，1997)。史艷霞等(2009)通過(guò)對(duì)Cry1Ac抗性和敏感棉鈴蟲Helicoverpa armigera幼蟲中腸類胰蛋白酶和類胰凝乳蛋白酶基因的半定量RT－PCR測(cè)定證明:相同蟲齡的抗性品系棉鈴蟲體內(nèi)的類胰蛋白酶和類胰凝乳蛋白酶的表達(dá)量明顯高于敏感品系。張繼紅等 (2001)研究發(fā)現(xiàn)棉鈴蟲中腸液的各分離組分都可對(duì)δ－內(nèi)毒素進(jìn)行降解，說(shuō)明δ－內(nèi)毒素的降解活化是多種蛋白酶共同作用的結(jié)果，但類胰蛋白酶對(duì)δ－內(nèi)毒素的降解速率顯著快于其它分離組分的蛋白酶。而梁革梅等 (2001)研究發(fā)現(xiàn)，棉鈴蟲抗感品系的弱堿性類胰蛋白酶和類凝乳蛋白酶活力差異不顯著，但強(qiáng)堿性類胰蛋白酶差異較大，說(shuō)明棉鈴蟲對(duì)Bt毒素產(chǎn)生抗性可能與中腸強(qiáng)堿性類胰蛋白酶活性的增強(qiáng)有關(guān)。徐艷聆等對(duì)取食轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米的亞洲玉米螟O.furnacalis幼蟲體內(nèi)的中腸蛋白酶研究后也發(fā)現(xiàn)，弱堿性類胰蛋白酶和類胰凝乳蛋白酶的活力差異不顯著，但強(qiáng)堿性類胰蛋白酶的活性顯著高于對(duì)照。推斷強(qiáng)堿性類胰蛋白酶可能與亞洲玉米螟對(duì)Bt毒素抗性的產(chǎn)生有關(guān) (徐艷聆等，2006a;2006b)。相反，李光濤 (2004)報(bào)道歐洲玉米螟抗性種群的強(qiáng)堿性類胰蛋白酶的活力明顯低于敏感種群。Oppert等 (1997)也報(bào)道印度谷螟的抗性種群強(qiáng)堿性類胰蛋白酶活力顯著低于敏感種群。

2 解毒酶

大多數(shù)研究認(rèn)為，解毒酶在昆蟲對(duì)殺蟲劑的解毒方面起著至關(guān)重要的作用，且與害蟲對(duì)殺蟲劑產(chǎn)生抗性有關(guān) (鄧業(yè)成等，1995;劉澤文等，2003;黃水金等，2007;Armes et al.，1997;Cho et al.，1999)。相對(duì)而言，Bt毒蛋白對(duì)昆蟲體內(nèi)解毒酶活性的影響及解毒酶與抗性之間關(guān)系的研究則較少。盡管如此，目前已有少量報(bào)道證明昆蟲的解毒酶系受Bt毒素的影響，解毒酶可能直接參與了Bt殺蟲蛋白的代謝作用并與抗性的形成有關(guān)(梁革梅等，2001)。

昆蟲體內(nèi)的解毒酶系主要是以羧酸酯酶、谷胱甘肽－S－轉(zhuǎn)移酶、乙酰膽堿酯酶為代表的酶系，它們對(duì)分解外源毒素、維持昆蟲本身正常的生理代謝起著重要作用。

2.1 羧酸酯酶 (carboxylesterase，CarE)

酯酶 (esterases)是昆蟲體內(nèi)一類重要的解毒酶系，它作為水解酯類的酶在許多昆蟲抗藥性中起著十分重要的作用。羧酸酯酶作為B－酯酶或酯族酯酶在有機(jī)磷抗性中的作用極為重要，其次是對(duì)擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的抗性 (唐振華，1993)。在昆蟲與Bt毒蛋白的抗性關(guān)系中，有研究表明該酶同樣起著很重要的作用。Guo等 (2010)用Bt毒蛋白連續(xù)飼養(yǎng)甜菜夜蛾Spodoptera exigua 3代后發(fā)現(xiàn)，該蟲第二代和第三代體內(nèi)的羧酸酯酶含量顯著高于第一代，它成為甜菜夜蛾逐漸適應(yīng)Bt毒素的重要證據(jù)。張少燕等 (2004)研究發(fā)現(xiàn)，棉鈴蟲幼蟲取食含不同濃度Bt毒蛋白的人工飼料后，體內(nèi)的羧酸酯酶活力隨Bt毒蛋白濃度的升高呈上升趨勢(shì)。Candas比較了印度谷螟抗性種群和敏感種群后發(fā)現(xiàn)，抗性種群體內(nèi)的羧酸酯酶活性比敏感種群體內(nèi)的高，這意味著羧酸酯酶活性的升高有可能是抗性產(chǎn)生的原因之一 (Candas et al.，2003)。但也有研究表明，羧酸酯酶與昆蟲對(duì)Bt毒素抗性的產(chǎn)生無(wú)關(guān):張炬紅等 (2006)研究了在抗蟲棉GK12上取食1代和21代的棉蚜Aphis gossypii，發(fā)現(xiàn)其羧酸酯酶活力與取食親本常規(guī)棉的棉蚜之間差異不顯著。許新軍 (2005)研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)Bt抗性和敏感品系的棉鈴蟲體內(nèi)羧酸酯酶活性也沒(méi)有顯著差異;另外，對(duì)斜紋夜蛾Spodoptera litura、煙粉虱Bemisia tabaci等的研究都表明羧酸酯酶與昆蟲對(duì)Bt毒蛋白的抗性無(wú)關(guān) (楊進(jìn)等，2008;姜濤等，2008)。

2.2 谷胱甘肽－S－轉(zhuǎn)移酶 (glutathione S transferases，GSTs)

GST是一類催化內(nèi)源還原谷胱甘肽(glutathione，GSH)與包括殺蟲劑在內(nèi)的各種外源化合物共軛作用的胞液酶。其功能是內(nèi)源GSH與有害的親電子基團(tuán)結(jié)合，并把它們排泄出體外(郭慶龍，2007)。谷胱甘肽－S－轉(zhuǎn)移酶的研究最早集中在家蠅與有機(jī)磷的關(guān)系上，發(fā)現(xiàn)該酶對(duì)抗藥性的產(chǎn)生起著重要作用?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，該酶活的變化與 Bt毒蛋白的抗性也有一定關(guān)系。Candas比較了印度谷螟抗性種群和敏感種群后發(fā)現(xiàn)，抗性種群體內(nèi)的GSTs活性比敏感種群體內(nèi)的高，這意味著GSTs活性的升高有可能是抗性產(chǎn)生的原因之一 (Candas et al.，2003)。當(dāng)然也有研究表明該酶與抗性的產(chǎn)生無(wú)關(guān)。姜濤等 (2008)測(cè)定了取食轉(zhuǎn)雙價(jià)基因棉SGK321及其親本棉SY321煙粉虱體內(nèi)谷胱甘肽－S－轉(zhuǎn)移酶的活性發(fā)現(xiàn)，SGK321對(duì)煙粉虱體內(nèi)谷胱甘肽－S－轉(zhuǎn)移酶活性均值無(wú)顯著影響。許新軍 (2005)研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)Bt毒素產(chǎn)生抗性和敏感品系的棉鈴蟲體內(nèi)谷胱甘肽－S－轉(zhuǎn)移酶活性沒(méi)有顯著差異，這表明棉鈴蟲對(duì)Bt毒素的抗性與GSTs無(wú)關(guān)。

2.3 乙酰膽堿酯酶 (acetylcholine esterase，AChE)

乙酰膽堿酯酶是有機(jī)磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑的作用靶標(biāo)。有機(jī)磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑與乙酰膽堿酯酶結(jié)合形成復(fù)合體，然后發(fā)生酶的磷?；虬被柞；?，造成酶活被抑制。當(dāng)它被抑制后，乙酰膽堿 (acetylcholine，Ach)就在突觸處積累，過(guò)量的Ach造成去極化阻斷，從而抑制正常的神經(jīng)傳導(dǎo)并最終導(dǎo)致昆蟲的死亡 (郭慶龍，2007)。因此，該酶的變異會(huì)導(dǎo)致昆蟲對(duì)化學(xué)殺蟲劑產(chǎn)生抗性。但Bt毒蛋白的殺蟲機(jī)理與有機(jī)磷及氨基甲酸酯類殺蟲劑的作用機(jī)理不相同:一般認(rèn)為Bt毒蛋白對(duì)昆蟲的毒殺機(jī)理是:昆蟲攝入殺蟲蛋白之后，在昆蟲中腸強(qiáng)堿環(huán)境和蛋白水解酶的作用下，殺蟲蛋白晶體被溶解并激活，活化的蛋白引起中腸膜上皮細(xì)胞破裂、中腸麻痹，導(dǎo)致昆蟲死亡 (喻子牛，1990)。從這個(gè)機(jī)理看，昆蟲對(duì)Bt毒蛋白產(chǎn)生抗性與乙酰膽堿酯酶的變化并沒(méi)有直接聯(lián)系，也有研究表明兩者之間是無(wú)關(guān)聯(lián)的。如張炬紅等 (2006)研究發(fā)現(xiàn)在抗蟲棉GK12上取食1代和21代的棉蚜，其乙酰膽堿酯酶的活力與取食親本常規(guī)棉的棉蚜之間無(wú)差異。姜濤等(2008)測(cè)定了取食轉(zhuǎn)雙價(jià)基因棉SGK321及其親本棉SY321后煙粉虱體內(nèi)乙酰膽堿酯酶的活性，發(fā)現(xiàn)SGK321對(duì)煙粉虱體內(nèi)乙酰膽堿酯酶活性均值無(wú)顯著影響。徐艷聆等 (2006b)通過(guò)比較對(duì)Cry1Ab殺蟲蛋白產(chǎn)生抗性的亞洲玉米螟種群和敏感種群幼蟲體內(nèi)解毒酶后發(fā)現(xiàn)，抗、感種群的乙酰膽堿酯酶活力差異不顯著?？梢?jiàn)，Bt毒蛋白對(duì)AChE的活力無(wú)顯著影響。但國(guó)外的研究發(fā)現(xiàn)，Bt毒蛋白也能作用于昆蟲的突觸前末梢從而抑制突觸傳導(dǎo) (Singh and Gill，1985;Chilcotta et al.，1984)，最終對(duì)神經(jīng)產(chǎn)生麻痹作用。由此看來(lái)，乙酰膽堿酯酶活性的變化也可能與昆蟲對(duì)Bt毒素產(chǎn)生抗性有關(guān)。張少燕等 (2004)研究發(fā)現(xiàn)，棉鈴蟲幼蟲取食含不同濃度Bt毒蛋白的人工飼料后，體內(nèi)乙酰膽堿酯酶活力隨Bt毒蛋白濃度的升高呈上升趨勢(shì)。梁革梅等研究發(fā)現(xiàn)，棉鈴蟲Bt抗性種群體內(nèi)的乙酰膽堿酯酶活力顯著高于敏感種群，并認(rèn)為乙酰膽堿酯酶作為分解代謝酶可能直接參與了Bt的代謝作用 (梁革梅等，2001)。張健華(2001)研究也證明乙酰膽堿酯酶的活力是棉鈴蟲對(duì)Bt棉產(chǎn)生抗性的重要原因。Guo等 (2010)通過(guò)用Bt毒蛋白連續(xù)飼養(yǎng)甜菜夜蛾3代后發(fā)現(xiàn)，第一代用Bt毒蛋白飼養(yǎng)的甜菜夜蛾體內(nèi)的乙酰膽堿酯酶含量顯著少于對(duì)照，但到了第二代、第三代體內(nèi)的乙酰膽堿酯酶含量已顯著高于第一代，說(shuō)明乙酰膽堿酯酶是甜菜夜蛾后代適應(yīng)Bt毒蛋白的重要因素。以上兩種截然不同的結(jié)論是否與害蟲種類有關(guān)或是其他原因還需要進(jìn)一步研究探討。

3 保護(hù)酶

超氧化物歧化酶 (superoxidedismutase，SOD)、過(guò)氧化氫酶 (catalase，CAT)和過(guò)氧化物酶 (peroxidase，POD)是生物體內(nèi)普遍存在的三種防御氧化損傷的重要保護(hù)酶 (李周直等，1994;李會(huì)平等，2006)。SOD和CAT廣泛存在于昆蟲體內(nèi)，POD在大多數(shù)昆蟲體內(nèi)也已發(fā)現(xiàn)，但在許多鱗翅目昆蟲中腸內(nèi)未發(fā)現(xiàn)其活性，如甜菜夜蛾、粉紋夜蛾 Trichoplusia ni、大豆夜蛾 Pseudoplusia includens和煙草夜蛾 Heliothis virescens。值得一提的是，上述POD活性的測(cè)試是用專一性不強(qiáng)的底物愈創(chuàng)木酚 (guaiacol)。該方法也許不能完全反映昆蟲體內(nèi)的真實(shí)情況 (毅平和龔和，1998;Felton and Summers，1995)。

據(jù)研究，當(dāng)昆蟲取食Bt毒蛋白后可能會(huì)使體內(nèi)保護(hù)酶的平衡遭到破壞，過(guò)量的O2－就會(huì)使機(jī)體損傷。此時(shí)昆蟲就會(huì)以升高保護(hù)酶活性的方式來(lái)保護(hù)和維持機(jī)體的正常功能，從而對(duì)Bt毒蛋白產(chǎn)生抗性 (張志罡等，2011)。Ding等 (2001)研究證明，昆蟲的保護(hù)酶受Cry1Ab蛋白的影響而發(fā)生變化，推測(cè)它可能參與了Cry1Ab蛋白的代謝作用并與抗性的產(chǎn)生有關(guān)。郭建英 (2010)等發(fā)現(xiàn)超氧化物歧化酶在對(duì)Bt毒素或其他次生代謝化合物的快速解毒過(guò)程中起著重要作用。對(duì)于保護(hù)酶與昆蟲對(duì)Bt毒素抗性方面的研究報(bào)道還較少，有待進(jìn)一步探索。

4 小結(jié)

雖然Heckel分析了昆蟲對(duì)Bt毒素產(chǎn)生抗性的10種潛在機(jī)理，但至今未有定論。根據(jù)本文的綜述，昆蟲體內(nèi)三大酶系與Bt毒素抗性產(chǎn)生的關(guān)系也不完全一致。這可能與昆蟲種類、轉(zhuǎn)Bt基因作物、基因?qū)敕绞降炔煌嘘P(guān)。如用取食含Bt毒蛋白的人工飼料與直接取食轉(zhuǎn)基因作物相比，外源殺蟲基因的導(dǎo)入可能會(huì)使作物體內(nèi)的次生代謝物質(zhì)或營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量發(fā)生改變，從而引起昆蟲體內(nèi)一些酶活的變化，最終導(dǎo)致研究結(jié)論的不同(武予清等，2000;張永軍和郭予元，2000)。因此，多方位、多角度以及長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)昆蟲對(duì)Bt毒素產(chǎn)生抗性的機(jī)制，將有助于進(jìn)一步篩選、利用最有效的Bt毒素，發(fā)展多樣化Bt制劑及轉(zhuǎn)Bt基因作物，延長(zhǎng)Bt制劑和Bt植物的使用壽命。

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