■張媛媛 陽艷林 黃廣明 勞 曄

（建明工業(yè)（珠海）有限公司，廣東珠海 519040）

益生菌（probiotics）即對人和動物有益的細(xì)菌。人們常把應(yīng)用于畜牧業(yè)生產(chǎn)上的益生菌稱為微生物飼料添加劑[1]。2001年，F(xiàn)AO/WHO（聯(lián)合國糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織）將益生菌定義為“攝入量足夠時(shí)對機(jī)體產(chǎn)生有益作用的活性微生物”[2]。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們對益生菌的研究更加深入，益生菌的定義也在不斷的變化與完善中。2006年，意大利學(xué)者M(jìn).Del Piano和L.Morelli等認(rèn)為益生菌應(yīng)該定義為“在一定程度上能耐受胃液，膽汁和胰臟分泌物而黏附于腸道上皮細(xì)胞，并在空腸和回腸大量繁殖的一類活的微生物”[3]。這一定義在一定程度上，更符合益生菌制劑在對人和動物發(fā)生益生作用時(shí)所經(jīng)歷的生物過程。益生菌制劑在被人或動物食用后，只有在大量活菌順利抵達(dá)、黏附并成功定植于回腸和結(jié)腸部位時(shí)，才能對宿主發(fā)揮益生作用[4]。在這一消化過程中，胃部的低pH值環(huán)境及胃液中胃蛋白酶等抗菌物質(zhì)就成為阻礙益生菌進(jìn)入腸道的第一道天然屏障。因此，菌體細(xì)胞對胃腸道環(huán)境具有較高的耐受性成為篩選優(yōu)良益生菌菌株的關(guān)鍵標(biāo)準(zhǔn)之一[5-6]。

本試驗(yàn)對市售5種微生物飼料添加劑的胃腸道環(huán)境耐受性做了比較研究，以期為該類產(chǎn)品的使用提供依據(jù)，幫助消費(fèi)者更好的識別優(yōu)質(zhì)的益生菌產(chǎn)品。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

克洛生TM是一種芽孢桿菌類微生物飼料添加劑，主要成分為枯草芽孢桿菌PB6菌株，由建明工業(yè)（珠海）有限公司提供。另4種來自不同公司生產(chǎn)的市售微生物飼料添加劑A、B、C、D，由建明工業(yè)（珠海）有限公司在市場上收集提供。產(chǎn)品A、B屬于芽孢桿菌類制劑，產(chǎn)品C、D屬于乳酸菌類屎腸球菌制劑，其中產(chǎn)品D為經(jīng)包被處理的乳酸菌，詳情見表1。

1.1.2 培養(yǎng)基及主要試劑

菌落計(jì)數(shù)培養(yǎng)基（PCA），PBS緩沖液、胃蛋白酶、胰蛋白酶、豬膽鹽、氯化鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氫氧化鈉等。

1.1.3 主要器材

立式壓力蒸汽滅菌鍋LS-B50L-Ⅲ型（購自江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司）、氣浴恒溫振蕩器THZ-82(購自江蘇金壇市佳美儀器有限公司)、生化培養(yǎng)箱SPX-100B-Z型（購自上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）、ESCO二級生物安全柜（購自北京五洲東方科技發(fā)展有限公司）等。

1.2 方法

1.2.1 人工胃液制備

取稀鹽酸16.4 ml，加去離子水800 ml,充分?jǐn)嚢韬螅{(diào)節(jié)pH值至2.5,去離子水定容至1 L，121℃高壓滅菌15 min后，冷卻至室溫，加入胃蛋白酶10 g，混合使其充分溶解。

1.2.2 人工腸液制備

取磷酸二氫鉀6.8 g，加去離子水500 ml，充分?jǐn)嚢枞芙猓?.1 mol/l氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6.8，去離子水定容至1 L 121℃高壓滅菌15 min后，冷卻至室溫，加入胰蛋白酶10 g，豬膽鹽3 g（0.3%），混合使其充分溶解。

1.2.3 體外模擬胃腸道消化試驗(yàn)

精密稱取1.000 g樣品，無菌操作下，置于150 ml錐形瓶中，加入20 ml人工胃液，同時(shí)將瓶子放入恒溫振蕩搖床37℃、90 r/min培養(yǎng)1 h。然后加入80 ml人工腸液，37 ℃，120 r/min繼續(xù)培養(yǎng)2 h。吸取1 ml培養(yǎng)后的菌懸液于9 ml PBS緩沖液中作系列稀釋（此為10-3稀釋度），根據(jù)樣品大致活菌數(shù)含量，稀釋到合適的濃度梯度，最后采用平板菌落計(jì)數(shù)法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

1.2.4 活菌計(jì)數(shù)及耐受率計(jì)算

采用平板菌落計(jì)數(shù)法[7]。

胃腸道耐受率(%)=胃腸模擬耐受之后的活菌總數(shù)/未經(jīng)耐受的活菌總數(shù)×100。

2 結(jié)果與分析

由表1可知，5種微生物飼料添加劑產(chǎn)品的胃腸道環(huán)境耐受性存在很大差異，克洛生的耐受率相對較好，達(dá)到55.1%；產(chǎn)品B和D的耐受率相近，分別為32.8%和42%。產(chǎn)品C的耐受率為1.12%，對胃腸道環(huán)境的抵抗力較差，而產(chǎn)品A經(jīng)胃腸耐受試驗(yàn)后，耐受率接近0，即無法抵抗胃酸環(huán)境和腸道內(nèi)的高膽鹽滲透壓作用，菌株大部分失活，不能發(fā)揮益生作用。

由于芽孢具有較強(qiáng)的抗逆性，芽孢桿菌在營養(yǎng)條件不充足或經(jīng)受不良環(huán)境作用時(shí)，會產(chǎn)生芽孢幫助其存活，而乳酸菌的抗逆性相對較弱，在逆境下更容易失活。因此，多數(shù)芽孢桿菌類制劑的胃腸道環(huán)境耐受性要高于乳酸菌類制劑。試驗(yàn)結(jié)果證明，乳酸菌類產(chǎn)品C未經(jīng)任何包被，耐受性很差，而同屬于乳酸菌類的產(chǎn)品D，由于進(jìn)行了包被技術(shù)處理，對菌體起到了保護(hù)作用，其耐受性相對較好。克洛生、產(chǎn)品A、產(chǎn)品B同屬于芽孢桿菌類制劑，但這3種產(chǎn)品的耐受性之間仍然存在很大的差異，且益生菌制劑所含活菌數(shù)越高，其益生效果并不一定越好。由此可見，不同益生菌菌種間生物特性差異很大，即使屬于同一菌種的不同菌株間，各項(xiàng)生物性能依然差異顯著。

3 討論

目前我國微生物飼料添加劑的法規(guī)并不健全，進(jìn)行質(zhì)量評定時(shí)，只有參照《微生物飼料添加劑技術(shù)通則》，除此之外，并無其他關(guān)于微生物飼料添加劑的統(tǒng)一質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[8]。如今的微生物飼料添加劑市場上，產(chǎn)品種類五花八門，質(zhì)量性能參差不齊，優(yōu)劣產(chǎn)品魚龍混雜，面對眼花繚亂的益生菌產(chǎn)品更是無法辨別其優(yōu)劣。因此，消費(fèi)者在選取益生菌產(chǎn)品時(shí)，除了關(guān)注益生菌的抑菌效果和抑菌譜以外，也應(yīng)該關(guān)注以下幾方面：①產(chǎn)品菌種、作用和主要用途標(biāo)示明確，活菌數(shù)標(biāo)示量與實(shí)際值要相符，雜菌污染低，產(chǎn)品穩(wěn)定性好。②有些益生菌產(chǎn)品要混入動物飼料中進(jìn)行制粒處理，這一類產(chǎn)品要注意對高溫高壓的耐受性如何，是否能抵抗高溫制粒的加工工藝，避免失活。③無論如何，益生菌最終必然要通過人或動物的消化系統(tǒng)進(jìn)入腸道內(nèi)發(fā)揮作用，因此，對胃酸和胃蛋白酶的耐受能力、抵抗膽汁酸鹽高滲透壓的能力等成為決定優(yōu)質(zhì)益生菌最關(guān)鍵的性能之一。④除此之外，還要根據(jù)實(shí)際面臨的問題，重點(diǎn)關(guān)注益生菌產(chǎn)品的產(chǎn)消化酶能力、產(chǎn)酸能力以及與抗生素的兼容性等方面，最終選取最能滿足自身需求的產(chǎn)品。

本試驗(yàn)僅對市售5種微生物飼料添加劑產(chǎn)品的胃腸道環(huán)境耐受性進(jìn)行了比較。研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌類制劑的胃腸道耐受性普遍高于乳酸菌類制劑。即使同屬于芽孢桿菌制劑，不同菌株間的耐受性也存在很大的差異。例如產(chǎn)品A與B同屬于芽孢桿菌類制劑，而產(chǎn)品A的胃腸道耐受性卻最差。因此，選擇益生菌產(chǎn)品時(shí)，一定要充分了解其綜合性能，單純一項(xiàng)指標(biāo)較高，仍然無法保證其發(fā)揮益生作用以致最終達(dá)不到預(yù)期的效果。盲目選擇益生菌產(chǎn)品不但起不到益生作用，還會帶來不必要的經(jīng)濟(jì)損失，只有根據(jù)實(shí)際情況，科學(xué)合理的選用微生物飼料添加劑，讓其充分發(fā)揮綠色微生態(tài)制劑的作用，才能帶來更大的經(jīng)濟(jì)效益。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，克洛生TM耐受率最高，為55.1%，對胃腸道逆境具有較強(qiáng)的抵抗力。產(chǎn)品A耐受率幾乎為零，無法抵抗胃腸環(huán)境破壞，菌體大部分失活，不能起到益生菌的作用。不同種類益生菌產(chǎn)品胃腸道耐受性存在顯著差異。即使屬于同一種屬的不同菌株間，胃腸道耐受性仍差異顯著。