何芒芒，張 蕓，任婧楠，王可興，潘思軼，范 剛

( 環(huán)境食品學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖北武漢430070)

β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)又稱β-D 葡萄糖苷水解酶。它包括一個(gè)異構(gòu)組的酶，能夠水解雙糖或者低聚糖的β-葡萄糖苷鍵以及其它的葡萄糖共軛鍵，從而釋放出糖苷及其配基［1］。β-葡萄糖苷酶廣泛地分布于自然界中，并且在許多的生命過程中都扮演著關(guān)鍵的角色。其中包括香氣的釋放，生物體內(nèi)激素的激活，發(fā)芽過程中細(xì)胞壁寡糖的降解，纖維素生物質(zhì)的降解，糖脂的水解，生氰作用，以及次級(jí)代謝產(chǎn)物的改造等過程。在植物體中，β-葡萄糖苷酶的活性伴隨在一些進(jìn)程中，比如激素的激活，對(duì)于病原體，微生物，昆蟲，寄生植物以及食草動(dòng)物的防御機(jī)制，花的發(fā)育和色素沉著等。β-葡萄糖苷酶還被認(rèn)為在細(xì)胞壁降解的過程中起到一定的作用。一些植物來源的β-葡萄糖苷酶具有高度的底物專一性，按照其對(duì)底物的特異性還可以大致將其分為3 類:第一類是只能水解烴基-β-葡萄糖苷的酶，這類β-葡萄糖苷酶能夠水解纖維二糖等;第二類是只能水解芳香基-β-葡萄糖苷的酶，這類酶能水解對(duì)硝基苯-β-D-葡萄糖苷等類似物;第三類是能夠水解烴基-β-葡萄糖苷或芳香基-β-葡萄糖苷的酶，此類β-葡萄糖苷酶能水解纖維二糖、對(duì)硝基苯-β-D-葡萄糖苷等［2-3］。在過去的二十年中，β-葡萄糖苷酶受到了人們大量的關(guān)注，主要是因?yàn)樗谑澄锱哦?，生物質(zhì)轉(zhuǎn)化以及酒和飲料的增香等領(lǐng)域的應(yīng)用。除此之外，β-葡萄糖苷酶還可以用于各種糖苷的合成，這些糖苷在食品，化妝品，制藥以及洗滌劑等領(lǐng)域有著很高的商業(yè)價(jià)值。例如:烷基糖苷因具有良好的表面活性劑性能、低毒性以及良好的生物降解性，已成為一種最具前景的非離子型表面活性劑。此外，許多糖苷還具有抗氧化、降低血糖水平、保護(hù)膜不受冷凍的侵害以及抑制酪氨酸酶等生物活性。目前，國內(nèi)外的研究學(xué)者已經(jīng)對(duì)各種來源的β-葡萄糖苷酶的提取、純化及酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了大量的研究。但是，對(duì)于柑橘中的β-葡萄糖苷酶的研究還比較少。并且，內(nèi)源糖苷水解酶在糖苷香氣前體體內(nèi)形成與水解釋放中的作用及其影響因素也少見報(bào)道。柑橘的果實(shí)中也含有β-葡萄糖苷酶。最值得關(guān)注的是β-葡萄糖苷酶與柑橘果實(shí)的香氣有著一定的聯(lián)系。國內(nèi)外研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)，糖苷類香氣前體的水解釋放可以顯著地增強(qiáng)水果及其加工制品的整體香氣品質(zhì)，是增強(qiáng)及保持水果及其加工制品良好香氣品質(zhì)的有效方法之一。而β-葡萄糖苷酶是糖苷類香氣前體水解釋放的關(guān)鍵酶［4-6］。因此，對(duì)于柑橘中β-葡萄糖苷酶的研究可以為柑橘果實(shí)香氣的形成機(jī)理、增香調(diào)控、提高柑橘加工制品的品質(zhì)等提供理論指導(dǎo)。

1 柑橘中β-葡萄糖苷酶的酶活測定以及分離純化方法

柑橘的果皮、果汁以及果肉中都存在β-葡萄糖苷酶。由于柑橘的不同組織部位的形態(tài)及理化性質(zhì)不同，以及各個(gè)組織部位中β-葡糖糖苷酶含量也不同，因此，柑橘不同組織部位中β-葡萄糖苷酶的活性也是不同的。Burns 和Baldwin 研究發(fā)現(xiàn)葡萄柚白皮層中β-葡萄糖苷酶活性最高，其次為果皮，而果汁中的活性最低［7］。Barbagallo 等研究也發(fā)現(xiàn)血橙果肉中β-葡糖糖苷酶的酶活高于離心果汁中的酶活，他們由此得出結(jié)論，柑橘中的β-葡糖糖苷酶主要與固態(tài)部分結(jié)合緊密，有可能與果膠結(jié)合在一起［8］。

1.1 柑橘中β-葡萄糖苷酶的基本性質(zhì)［8-13］

目前有關(guān)柑橘中β-葡萄糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)的研究很少，只有血橙和瓦倫西亞甜橙中的β-葡萄糖苷酶的相關(guān)研究報(bào)道。

血橙(Citrus sinensis(L)Osbeck Tarocco)粗汁中β-葡萄糖苷酶的酶活約為1.5 ×10-3U/g，被檢出的分子量為55、65ku，Km 值為0.267mmol/L，最適pH為4.5，最適反應(yīng)溫度為60℃，75℃時(shí)的D 值為3min，Z 值為9.5℃，具有良好的熱穩(wěn)定性，其在血橙成熟過程中酶活呈現(xiàn)上升趨勢，然后降低，此外，葡萄糖對(duì)其活性具有明顯的抑制作用，但是果糖和乙醇對(duì)其活性沒有影響［8］。

瓦倫西亞甜橙(Citrus sinensis var.Valencia)中的β-葡萄糖苷酶經(jīng)Superdex 凝膠過濾層析處理后的酶活為11ku，經(jīng)Toyopearl HW-55S 凝膠過濾層析處理后測得的酶活為24.5ku，而再經(jīng)BioGel P-100 柱純化后測得的酶活則為55ku。該品種柑橘中β-葡萄糖苷酶的最適pH 為4.5～5.5，在pH5.0 時(shí)的最適反應(yīng)溫度為40～45℃，Km 值為0.1146mmol/L［4］。

此外，Burns 曾對(duì)瓦倫西亞甜橙汁中的糖苷酶在貯藏過程中的變化進(jìn)行了研究，并發(fā)現(xiàn)α-半乳糖苷酶酶活在8 周的貯藏期中穩(wěn)定，而β-半乳糖苷酶酶活在這一階段下降了;經(jīng)離子交換和凝膠過濾層析純化后，他們發(fā)現(xiàn)瓦倫西亞橙汁中的α-和β-半乳糖苷酶分別有兩種異構(gòu)體，其Km 值分別為0.47(α-半乳糖苷酶Ⅰ)、0.23(α-半乳糖苷酶Ⅱ)、0.27(β-半乳糖苷酶Ⅰ)和0.77(β-半乳糖苷酶Ⅱ)mmol/L［9］。Burns 和 Baldwin 對(duì)葡萄柚(Citrus paradisi Macf.cv.Ruby Red)果皮、白皮層及果汁中的其他糖苷酶在成熟過程中的變化進(jìn)行了研究，但并未對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行測定，他們發(fā)現(xiàn)葡萄柚果皮中的β-半乳糖苷酶酶活在9 月份最高，然后急劇下降，直到11 月份后無明顯變化，果皮中的α-半乳糖苷酶酶活很低，且在葡萄柚成熟過程中無明顯變化，而果皮中的α-甘露糖苷酶酶活在采摘初期酶活很低，隨著果實(shí)的成熟，其酶活穩(wěn)步提高;葡萄柚白皮層中的這些糖苷酶的酶活變化規(guī)律與果皮中的差別不大;而果汁中的β-半乳糖苷酶酶活在整個(gè)成熟期變化不大，果汁中的α-半乳糖苷酶和α-甘露糖苷酶酶活在初期采收后酶活分別降低了70%和50%［7］。

1.2 柑橘的不同部位粗酶液的制備方法

柑橘皮中β-葡萄糖苷酶粗酶液的制備方法為:將柑橘皮用一定量的檸檬酸-磷酸緩沖液(pH6.0)，冰浴上充分研磨成勻漿，加緩沖液于4℃下浸提60min，然后于10000 × g 冷凍離心15min，然后取上清液用相應(yīng)的緩沖液定容得粗酶液。

柑橘果汁中β-葡萄糖苷酶粗酶液的制備方法為:將柑橘去皮榨汁后直接于20000 × g 冷凍離心30min，上清液可直接測定酶活。所得的沉淀物用一定量的檸檬酸-磷酸緩沖液(pH6.0)于4℃浸提60min，然后于10000 × g 冷凍離心15min，取上清液用相應(yīng)的緩沖液定容得粗酶液。

1.3 柑橘中β-葡萄糖苷酶酶活的測定方法

柑橘中β-葡萄糖苷酶酶活的測定方法主要有三種，第一種是光譜法，該法是根據(jù)柑橘中β-葡萄糖苷酶在一定的溫度和時(shí)間條件下可以催化底物p-NPG，生成對(duì)硝基苯酚。對(duì)硝基苯酚在堿性條件下于402nm 左右處有最大吸收峰，因此，可以以p-NPG為底物通過反應(yīng)產(chǎn)物的顯色來檢測酶活。具體的方法為，在試管中加入一定量的粗酶液，然后加入10mmol/L 的p-NPG，在一定的溫度下反應(yīng)一段時(shí)間后加入1mol/L 的Na2CO3終止反應(yīng)。然后在402nm 左右測吸光度，再根據(jù)對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出酶活［4，8，10］。第二種方法是通過測定釋放出的葡萄糖的含量來計(jì)算β-葡萄糖苷酶的酶活。根據(jù)β-葡萄糖苷酶能夠水解β-低聚糖或者β-葡萄糖苷釋放出葡萄糖，釋放出的葡萄糖再采用離子交換色譜脈沖安培檢測器(HPAEC-PAD)進(jìn)行檢測，響應(yīng)值和糖濃度呈正相關(guān)關(guān)系，并以2-去氧半乳糖為內(nèi)標(biāo)物確定釋放出的糖含量，從而可計(jì)算出β-葡萄糖苷酶的酶活。第三種方法是通過測定釋放出的柑橘中的酚類物質(zhì)來計(jì)算β-葡萄糖苷酶的酶活。具體操作是將β-葡萄糖苷酶和一定濃度的橙皮素二氫查耳酮葡萄糖苷、橙皮素-7-O-葡糖苷等糖苷在40℃條件下反應(yīng)2h，然后浸入沸水浴中保持5min 以終止反應(yīng)，再采用高效液相色譜法測定釋放出的酚類物質(zhì)的含量，從而確定β-葡萄糖苷酶的酶活［4］。

1.4 柑橘中β-葡糖糖苷酶的分離和純化方法

由于不同來源的β-葡萄糖苷酶性質(zhì)差異很大，因此，一般沒有適合各種不同體系中的β-葡萄糖苷酶的分離純化的固定方法。但所有分離純化方法的關(guān)鍵步驟、基本手段還是基本一致的。一般來說，分離的第一步是將細(xì)胞破碎，使內(nèi)含物從細(xì)胞中釋放出來。第二步就是制備粗酶液，然后就可以采用幾種溶解度分級(jí)法進(jìn)行初步分離，再進(jìn)一步純化。

一般采用多種離子交換層析結(jié)合的方法來進(jìn)行分離純化柑橘中的β-葡萄糖苷酶。首先由柑橘果實(shí)制備粗酶液，然后使用硫酸氨(80%飽和度)沉淀，再用聚丙烯酰胺凝膠(12%)進(jìn)行電泳純化分析［8］;或者粗酶液分別經(jīng)過DEAE Sephacel、CM-Sepharose及凝膠過濾層析等多步純化在進(jìn)行分析［4］。

2 柑橘中β-葡萄糖苷酶對(duì)柑橘果實(shí)香氣的影響

香氣是影響柑橘果實(shí)以及其加工制品品質(zhì)的最重要因素之一，研究柑橘的香氣組成，對(duì)于防止柑橘加工過程中香氣物質(zhì)的損失、保持柑橘加工制品的特征香氣、提高其總體香氣品質(zhì)具有非常重要的意義。柑橘的香氣主要由酯類、醛類、萜烯類化合物等構(gòu)成，其中萜烯類化合物是柑橘果實(shí)香氣中含量最高的一類香氣物質(zhì)，由于這類物質(zhì)具有弱極性，所以它們更容易存在于果肉中。除游離態(tài)香氣物質(zhì)外，柑橘中還存在一類不具揮發(fā)性，與柑橘果實(shí)中的糖類物質(zhì)通過糖苷鍵結(jié)合，以糖苷的形式存在的香氣前體物質(zhì)，即糖苷鍵合態(tài)香氣物質(zhì)(glycosidically bound aroma compounds)［11］。

目前，有關(guān)柑橘中β-葡萄糖苷水解酶對(duì)其香氣品質(zhì)影響的研究鮮有報(bào)道，但外源β-葡萄糖苷酶對(duì)柑橘中鍵合態(tài)香氣物質(zhì)的水解釋放具有明顯的作用。Gueguen 等［12］研究發(fā)現(xiàn)，在橙汁中添加β-葡萄糖苷酶能夠明顯地增加芳樟醇、苯甲醇和苯乙醇的含量。宛曉春等［13］采用Amberlite XAD-2 樹脂吸附洗脫的方法對(duì)檸檬汁中的鍵合態(tài)萜類化合物進(jìn)行了分離，并應(yīng)用β-葡萄糖苷酶對(duì)其進(jìn)行了水解釋放，共檢出9 種鍵合態(tài)香氣物質(zhì)。孫愛東等［14］對(duì)甜橙中分離得到的的鍵合態(tài)香氣物質(zhì)進(jìn)行了β-葡萄糖苷酶酶解釋放，共發(fā)現(xiàn)8 種物質(zhì)，且酶解后的橙汁風(fēng)味典型溫和。孫愛東等［15］又比較了不同來源的增香酶酶解橙汁中鍵合態(tài)香氣物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)微生物來源的β-葡萄糖苷酶對(duì)鍵合態(tài)組分的酶解效果略強(qiáng)于杏仁酶的酶解效果。范剛等［16-17］也采用外源β-葡萄糖苷酶水解釋放出了錦橙中的鍵合態(tài)香氣物質(zhì)。葉順君等［18］則發(fā)現(xiàn)杏仁β-葡萄糖苷酶對(duì)橙汁和檸檬汁中鍵合態(tài)香氣物質(zhì)的酶解效果好于黑曲霉β-葡萄糖苷酶的酶解效果，且他們采用Kramer 感官評(píng)定法研究發(fā)現(xiàn)采用糖苷酶酶解橙汁具有明顯的增香效果。張瑤等［19］等研究了新鮮檸檬汁經(jīng)β-葡萄糖苷酶處理后香氣物質(zhì)的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)酶解后，檸檬汁中香氣物質(zhì)的總量增加了11%。由此可見，外源β-葡萄糖苷酶對(duì)柑橘汁的香氣物質(zhì)存在一定影響，能夠水解釋放柑橘中的鍵合態(tài)香氣物質(zhì)，增加柑橘香氣物質(zhì)的含量。Fan 等［20］比較了柑橘果酒中鍵合態(tài)香氣物質(zhì)釀造前后的變化，并發(fā)現(xiàn)共有8 種鍵合態(tài)香氣物質(zhì)在發(fā)酵過程中被水解釋放。

柑橘成熟過程中內(nèi)源β-葡萄糖苷酶也可以釋放出部分鍵合態(tài)萜類物質(zhì)，因此可通過外加β-葡萄糖苷酶增強(qiáng)柑橘加工制品及加工副產(chǎn)品的香氣與風(fēng)味。例如將β-葡萄糖苷酶應(yīng)用于柑橘精油、柑橘果酒以及柑橘汁的提取加工工藝中，使得產(chǎn)品的特征香氣更加濃郁。

3 柑橘中β-葡萄糖苷酶的其他作用

β-葡萄糖苷酶也可以分解一些苦味物質(zhì)，使得一些具有苦味的果實(shí)加工制品的口感得到改善。例如:梅子中含有大量的苦味物質(zhì)，使得其加工制品的口感較差。而這些苦味物質(zhì)中最主要的就是苦杏仁苷。β-葡萄糖苷酶可以分解苦杏仁苷，使得其苦味大大減輕。然而，在柑橘中則恰恰相反，檸檬苦素類化合物是柑橘中的主要苦味物質(zhì)。這類物質(zhì)在柑橘中與糖類物質(zhì)通過糖苷鍵結(jié)合以糖苷的形式存在，據(jù)報(bào)道，檸檬苦素類化合物糖苷在橙汁中的含量約為320mg/kg［21］，在柑橘種子中的含量達(dá)干重的0.8%［22］。檸檬苦素類化合物糖苷經(jīng)β-葡萄糖苷酶水解后，釋放出檸檬苦素類物質(zhì)，引起橙汁苦味。Ronneberg 等［23］研究發(fā)現(xiàn)未發(fā)芽及發(fā)芽檸檬種子中的諾米林17-β-D-吡喃葡萄糖苷(nomilin 17-β-D-glucopyranoside)被水解為諾米林，說明檸檬種子中含有水解糖苷的β-葡萄糖苷酶，并指出榨汁過程中種子被碾碎后，其中的β-葡萄糖苷酶融入果汁中容易水解檸檬苦素類物質(zhì)糖苷，釋放出苦味物質(zhì)，造成果汁的苦味，因此在榨汁過程中要盡量防止種子被碾碎。

β-葡萄糖苷酶還與血橙中花色苷的降解有一定關(guān)系，Barbagallo 等研究發(fā)現(xiàn)血橙中的花色苷含量在果實(shí)完熟時(shí)最高，之后減少，而在這個(gè)過程中，β-葡萄糖苷酶的活性增高，因此他們認(rèn)為，β-葡萄糖苷酶在血橙花色苷降解過程中起到了一定作用［8］。

β-葡萄糖苷酶存在于許多植物中，其在植物中的作用除水解糖苷鍵以外，還有很多未被發(fā)現(xiàn)的作用，國外研究報(bào)道水果中的β-葡萄糖苷酶在細(xì)胞壁代謝中也具有重要作用［24-25］。糖苷水解酶具有雙重性，即根據(jù)來源的不同，既可行水解酶活性，又可行糖基轉(zhuǎn)移酶活性，可以用于酶促糖苷化反應(yīng)［26］。

4 展望

β-葡萄糖苷酶分布于柑橘果實(shí)的各個(gè)部位，在柑橘果實(shí)鍵合態(tài)香氣水解釋放、檸檬苦素類物質(zhì)糖苷水解及花色苷降解過程中起到重要作用。然而由于β-葡萄糖苷酶對(duì)環(huán)境的條件較為敏感，極易在柑橘的采摘和加工過程成失活或者變性，從而無法對(duì)香氣的釋放做出貢獻(xiàn)。目前通過保持柑橘中β-葡萄糖苷酶的活性進(jìn)而保持柑橘果實(shí)及其加工制品的香氣主要有兩種途徑:一是盡量縮短采摘及加工的時(shí)間，在加工過程中避免長時(shí)間高溫處理。二是在制品中加入外源的β-葡萄糖苷酶。

目前，國內(nèi)外的研究學(xué)者已經(jīng)對(duì)各種不同來源的β-葡萄糖苷酶的提取、純化及酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了大量的研究。然而，對(duì)于柑橘中的β-葡萄糖苷酶的研究還比較少，尤其是內(nèi)源糖苷水解酶在糖苷香氣前體體內(nèi)形成與水解釋放中的作用及其影響因素也鮮有報(bào)道，其在柑橘中糖苷香氣前體合成及釋放中的作用需要進(jìn)一步明確。

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