王苑桃 雷成康 王 穎 謝志民 西安市食品藥品檢驗(yàn)所（西安710054）

活血止痛散（片）是2012年國家評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)項(xiàng)目，由當(dāng)歸、三七、制乳香、冰片、土鱉蟲、煅自然銅6味中藥組成，具有活血散瘀，消腫止痛的功效，主要用于跌打損傷，瘀血腫痛等癥。當(dāng)歸為方中君藥，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)以阿魏酸為標(biāo)的物，采用HPLC 方法進(jìn)行測定，但散劑現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)供試品溶液制備方法太過復(fù)雜，阿魏酸損失嚴(yán)重，測出率和限度偏低；片劑5個(gè)現(xiàn)行注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法各異，限度差異較大。制乳香為方中臣藥，具有活血止痛、消腫生肌的作用，現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)均無含量控制要求。本次研究參照中國藥典［1］等資料，本文建立了用可變檢測波長HPLC法測定成品中阿魏酸和11－羰基－β－乙酰乳香酸的含量測定方法，作為成品中當(dāng)歸和制乳香的質(zhì)量控制方法。

1 儀器與試藥 1.1 儀器 安捷倫1260型高效液相色譜儀，Agilent ChemStation for LC Systems色譜工作站；Kromasil C18（250mmX4.60mm 5μm）色譜柱；北京普析通用分析儀器有限責(zé)任公司TΜ－1800PC 型紫外可見分光光度計(jì)；昆山市超聲儀器有限公司KQ－700DE型數(shù)控超聲波清洗器。

1.2 試劑與試藥 乙腈為色譜純（美國天地公司），其它試劑均為分析純。阿魏酸對(duì)照品（110773－200611），11－羰基－β－乙酰乳香酸對(duì)照品（111760－200601），均為中國食品藥品生物制品檢定院提供（供含量測定用）。

2 方法與結(jié)果 2.1 色譜條件 采用十八烷基硅烷鍵合硅膠（250mm×4.6mm，5μm）色譜柱，以乙腈－0.1%冰乙酸為流動(dòng)相梯度洗脫（0→12min，18∶82；12→14min，18→90∶82→10；14→30min，90∶10；30→32min，90→18∶10→82；32→35min，18∶82），柱溫30℃，流速1.0mL／min，檢測波長0→15min為316nm，15→35min為250nm，進(jìn)樣量10μl。理論塔板數(shù)按阿魏酸峰計(jì)算應(yīng)不低于11000，以11－羰基－β－乙酰乳香酸峰計(jì)算應(yīng)不低于75000。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取阿魏酸對(duì)照品和11－羰基－β－乙酰乳香酸對(duì)照品適量，加甲醇制成每1mL 含阿魏酸4μg、11－羰基－β－乙酰乳香酸30μg的混合溶液，搖勻，即得。

2.3 供試品溶液的制備 取本品散劑裝量差異項(xiàng)下的粉末，研勻，精密稱取粉末0.5g；或取片劑重量差異項(xiàng)下的本品，研細(xì)（過三號(hào)篩），精密稱取粉末適量（相當(dāng)于含當(dāng)歸0.22g），置具塞錐形瓶中，精密加入2%甲酸甲醇溶液25mL，超聲處理（功率280W，頻率45kHz）30min，放涼，再稱定重量，用2%甲酸甲醇溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍 精密稱取阿魏酸對(duì)照品（批號(hào)110773－200611）10.60mg，置50mL 量瓶中，加甲醇使溶解，并加至刻度，搖勻，作為阿魏酸對(duì)照品儲(chǔ)備溶液；再精密稱取11－羰基－β－乙酰乳香酸對(duì)照品（批號(hào)111760－200601）9.93mg，置50mL量瓶中，加甲醇使溶解，并加至刻度，搖勻，作為11－羰基－β－乙酰乳香酸對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。精密吸取阿魏酸對(duì)照品儲(chǔ)備溶液5mL、11－羰基－β－乙酰乳香酸對(duì)照品儲(chǔ)備溶液20mL，置同一50mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為7號(hào)對(duì)照品溶液；精密吸取7 號(hào)對(duì)照品溶液10mL、5mL、3mL、2mL 和1mL，分別置25mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，分別作為6～2號(hào)對(duì)照品溶液；精密吸取7號(hào)對(duì)照品溶液1mL，置50mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為1號(hào)對(duì)照品溶液。精密吸取1～7號(hào)對(duì)照品溶液各10μl進(jìn)樣2次，按上述色譜條件測定峰面積，以峰面積平均值為縱坐標(biāo)，以進(jìn)樣量（ng）為橫坐標(biāo)，計(jì)算得阿魏酸回歸方程Y＝5.3638X－8.0448、r＝0.9997、11－羰基－β－乙酰乳香酸回歸方程Y＝1.3253X－0.7738、r＝0.9999，表明在該系統(tǒng)條件下，阿魏酸進(jìn)樣量在4.24ng～212ng范圍內(nèi)、11－羰基－β－乙酰乳香酸進(jìn)樣量在15.888ng～794.4ng范圍內(nèi)，峰面積積分值與進(jìn)樣量呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取上述5號(hào)對(duì)照品溶液10μl，各進(jìn)樣6次，按上述條件測定峰面積，計(jì)算變異系數(shù)。結(jié)果阿魏酸和11－羰基－β－乙酰乳香酸的RSD 分別為1.03%、1.38%，均小于1.5%，表明本實(shí)驗(yàn)精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取赤峰天奇制藥有限公司活血止痛散（批號(hào)為20100402）樣品粉末0.5g、江西山香藥業(yè)有限公司活血止痛片（批號(hào)為120502）樣品粉末0.6g各6份，置具塞錐形瓶中，分別精密加入2%甲酸甲醇溶液各25mL，稱定重量，超聲處理（功率280W，頻率45kHz）30min，取出，放涼，再稱定重量，用2%甲酸甲醇溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，棄去初濾液。精密吸取續(xù)濾液及標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下5號(hào)對(duì)照品溶液各10μl，注入液相色譜儀，按標(biāo)準(zhǔn)曲線考察項(xiàng)下的條件測定色譜峰面積，計(jì)算。結(jié)果散劑中阿魏酸和11－羰基－β－乙酰乳香酸RSD 分別為1.12%、0.82%，片劑中為1.10%、0.88%。表明散劑、片劑使用該方法測定阿魏酸和11－羰基－β－乙酰乳香酸的重復(fù)性均良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別在0、2、4、8、12、16、20、24h精密吸取同一份供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定阿魏酸和11－羰基－β－乙酰乳香酸峰面積，以峰面積計(jì)算，阿魏酸散（片）劑中RSD 為1.80%（1.41%）；11－羰基－β－乙酰乳香酸散（片）劑中RSD 為0.78%（0.62%）。結(jié)果表明樣品溶液中阿魏酸和11－羰基－β－乙酰乳香酸在24h內(nèi)穩(wěn)定，可滿足測定需要。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的供試品6份，加入一定量的阿魏酸和11－羰基－β－乙酰乳香酸的混合對(duì)照品溶液，按供試品溶液的制備方法進(jìn)行處理，按上述色譜方法進(jìn)行測定，計(jì)算回收率。結(jié)果顯示，散劑、片劑阿魏酸的平均加樣回收率分別為97.32%和97.20%，RSD 分別為2.73%和2.21%；11－羰基－β－乙酰乳香酸的平均加樣回收率分別為98.03%和99.02%，RSD 分別為2.44%和2.57%。

2.9 樣品含量測定 按供試品溶液的制備方法進(jìn)行處理，按上述色譜方法進(jìn)行測定，記錄峰面積，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算阿魏酸和11－羰基－β－乙酰乳香酸的含量，33批次活血止痛散中阿魏酸含量為141.7～467.7μg／g，11－羰基－β－乙酰乳香酸的含量為0.3031～3.1665mg／g；54批次活血止痛片中阿魏酸含量為41.5～341.8μg／片，11－羰基－β－乙酰乳香酸的含量為0～1103.1μg／片。

3 討 論 3.1 供試品制備方法的選擇 本品成分相對(duì)復(fù)雜，阿魏酸又不穩(wěn)定，中國藥典活血止痛散項(xiàng)下供試品溶液制備方法太過復(fù)雜，阿魏酸損失嚴(yán)重，測出率和限度明顯偏低；片劑YBZ30222005－2009Z、YBZ25062005－2010Z 標(biāo)準(zhǔn)采用70%甲醇加熱回流的方法，YBZ01112005－2009Z標(biāo)準(zhǔn)采用50%甲醇超聲處理的方法，YBZ02812006標(biāo)準(zhǔn)采用1%乙酸甲醇溶液超聲處理的方法，稀釋后甲醇提取，雜質(zhì)較多，回流提取破壞較大，對(duì)11－羰基－β－乙酰乳香酸的提取效果亦不佳。乳香、制乳香中11－羰基－β－乙酰乳香酸的含量測定資料［2－4］采用甲醇或丙酮超聲提取方法。考慮到11－羰基－β－乙酰乳香酸與阿魏酸一并提取、測定，為了提高測定方法回收率，盡量避免過多處理，減少樣品用量和色譜柱污染，預(yù)試驗(yàn)對(duì)甲醇、酸性甲醇超聲提取效果進(jìn)行了考察，并與回流方法對(duì)照，結(jié)果顯示以酸性甲醇超聲提取效果較好。遂采用正交實(shí)驗(yàn)對(duì)不同甲酸濃度、超聲時(shí)間和超聲功率的提取效果進(jìn)行考察，結(jié)果表明甲酸濃度、超聲功率和超聲時(shí)間對(duì)阿魏酸和11－羰基－β－乙酰乳香酸的測定結(jié)果均無顯著性影響。

3.2 檢測波長的確定 取上述阿魏酸和11－羰基－β－乙酰乳香酸對(duì)照品儲(chǔ)備溶液各1mL，分別加甲醇250mL，混勻，照可見－紫外分光光度法，在190～400nm 波長范圍內(nèi)作光譜掃描，結(jié)果阿魏酸對(duì)照品溶液在217nm、232nm 和316nm 處均有最大吸收，11－羰基－β－乙酰乳香酸對(duì)照品溶液在250nm 處有最大吸收，為了排除其它成分干擾，采用可變波長檢測方法，參照中國藥典選定阿魏酸檢測波長為316nm、11－羰基－β－乙酰乳香酸檢測波長為250nm。

［1］ 國家藥典委員會(huì).中國藥典［S］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010：956.

［2］ 張振凌，鄭玉麗.HPLC比較乳香炮制前后11－羰基－β－乙酰乳香酸含量［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，16（14）：51－53.

［3］ 王 淳，夏 磊，宋志前，等.乳香中五種乳香酸成分分析［J］.中國中藥雜志，2011，36（10）：1330－1333.

［4］ 劉元艷，王 超，夏 磊，等.活絡(luò)效靈顆粒中乳香酸類成分含量分析［J］.中藥研究，2011，13（5）：860－863.