王繼貴

(中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院，湖南長沙410011)

蛋白質(zhì)的氨甲?；鳛槁阅I衰時(shí)的生物標(biāo)志物

王繼貴

(中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院，湖南長沙410011)

許多研究已證實(shí)氨基甲酰化的蛋白質(zhì)涉及各種疾病的進(jìn)展，特別是慢性腎衰。本文的目的是介紹非酶促蛋白質(zhì)翻譯后修飾的概況以及其在體內(nèi)的影響，并評(píng)價(jià)其作為生物標(biāo)志物的臨床用途。

氨甲?；簧飿?biāo)志物；慢性腎衰

氨甲酰化是蛋白質(zhì)翻譯后的一種修飾，來自于異氰酸(isocyanic acid)共價(jià)結(jié)合到蛋白質(zhì)上，涉及在蛋白質(zhì)分子成熟(ageing)過程中非酶促反應(yīng)之一(即糖化、氧化或氨甲酰化)。這些翻譯后修飾的特征是在蛋白質(zhì)上形成共價(jià)結(jié)合的加合物，該加合物被稱作翻譯后修飾衍生的產(chǎn)物(posttranslationalmodification-derived products,PTMDPs),它可使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能特性發(fā)生改變[1]。

因?yàn)橛砂奔柞；瘉淼漠a(chǎn)物(carbamylation-derived products,CDPs)是有生物活性的化合物，它能觸發(fā)特殊的及不適當(dāng)?shù)募?xì)胞反應(yīng)，例如氨甲?；纱龠M(jìn)激素和酶失活、蛋白質(zhì)功能發(fā)生改變。CDPs在體內(nèi)的積聚，能誘導(dǎo)疾病的發(fā)生和進(jìn)展。監(jiān)測(cè)CDPs對(duì)特定疾病是一種可能的生化標(biāo)志物[2]，對(duì)慢性疾病復(fù)雜性的診斷和治療給予新的洞察力。本文擬對(duì)氨甲酰化研究的進(jìn)展作一簡(jiǎn)要介紹。

1 氨甲?；磻?yīng)的生物化學(xué)

氨甲?；傅氖羌釉诘鞍踪|(zhì)或氨基酸的功能基上的“氨基甲?！辈糠?-CONH2)，這個(gè)反應(yīng)主要來自于異氰酸和蛋白質(zhì)之間的相互作用。在體外，異氰酸鹽同氨基、硫醇和苯酚基或羧基相互作用，硫醇和苯酚基顯示有最高的反應(yīng)性，但是，它是可逆的，因此，限制了它對(duì)蛋白質(zhì)特性的影響。相反，氨基酸或蛋白質(zhì)的氨基不可逆地結(jié)合到異氰酸上，而且α-氨基比賴氨酸側(cè)鏈ε-氨基反應(yīng)快約100倍，因?yàn)樗鼈兊膒Ka較低。

在人類，異氰酸主要由血液中的尿素自發(fā)地分解形成氰酸鹽(-N＝C＝O)和含氨物質(zhì)，它在水溶液中發(fā)生，根據(jù)平衡反應(yīng)，它促成99%以上的尿素分解，形成的氰酸鹽迅速轉(zhuǎn)變成它的反應(yīng)型異氰酸(HN=C=O)[3]。因此，在慢性腎衰時(shí)(Chronic renal failure,CRF)其特征是長期高尿素血癥，它促進(jìn)異氰酸的形成。在健康個(gè)體中，血漿異氰酸的濃度大約為50nmol/L，而在CRF的病人中它達(dá)到150nmol/ L。在體內(nèi)，異氰酸和蛋白質(zhì)、氨基酸和其他分子之間相互作用，使得這些分子中的氨甲?；?，導(dǎo)致它們的結(jié)構(gòu)、電荷和功能發(fā)生改變。影響細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)的各種功能，出現(xiàn)慢性組織損害，是導(dǎo)致疾病發(fā)病機(jī)理的重要因素。有研究發(fā)現(xiàn)在CRF的腎組織中有氨甲?；牡鞍踪|(zhì)，但是在正常移植腎中則沒有[3]。

然而，尿素分解不是導(dǎo)致異氰酸形成的唯一途徑，特別是在非CRF的病人中。氰酸鹽也可來自硫氰酸鹽的代謝，在抽煙的人中，血中硫氰酸鹽濃度升高。在過氧化氫存在時(shí)，髓過氧化物酶催化H2O2氧化硫氰酸鹽(-N=C=S)生成氰酸鹽(-N=C=O)和次硫氰酸(HO-N=C=S)，氰酸鹽迅速地轉(zhuǎn)變成異氰酸，后者在炎癥中促進(jìn)蛋白質(zhì)的氨甲?；痆4]。

理論上講，體內(nèi)所有蛋白質(zhì)都可以氨甲?；Ｈ欢?，每種蛋白質(zhì)氨甲?；目赡苄?，取決于多種參數(shù)，如數(shù)量和氨基的可接近性，以及蛋白質(zhì)的壽命。不同的氨基參與反應(yīng)，則形成不同的氨甲酰化產(chǎn)物，當(dāng)α-氨基參與反應(yīng)時(shí)，則形成α-甲氨酰氨基酸(或α-甲氨酰蛋白質(zhì))；當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的賴氨酸ε-氨基參與反應(yīng)時(shí)，則形成ε-甲氨酰賴氨酸(也叫高瓜氨酸，homocitrulline)。血漿結(jié)合的高瓜氨酸水平，可獨(dú)立地預(yù)測(cè)冠心病、將來發(fā)生心肌梗死、腦卒中和死亡的危險(xiǎn)因素增加[4]。

2 病理生理學(xué)中涉及蛋白質(zhì)氨甲?；幕驹?/h2>

在人類，首次證實(shí)蛋白質(zhì)氨甲?；挠泻π?yīng)是在70年代初得出的。當(dāng)時(shí)用尿素治療鐮狀細(xì)胞貧血病人，因?yàn)樗茏铚?、甚至逆轉(zhuǎn)鐮狀形成。已提示有兩個(gè)機(jī)制解釋它的有益作用：(1)尿素分子本身直接干擾鐮狀化形成；(2)由尿素衍生的異氰酸致HbS的氨甲?；?，它增加氧的親和性以及降低聚集特性。后來用氰酸鈉(Sodium cyanate)作為一種口服治療劑，然而，已觀察到意外的副作用，某些病人在口服氰酸鈉的過程中發(fā)生了白內(nèi)障。這個(gè)現(xiàn)象可以用α-晶體蛋白氨甲?；瘉斫忉?，它誘導(dǎo)構(gòu)象改變，使晶體蛋白渾濁。長壽蛋白質(zhì)特別傾向于翻譯后修飾，氨甲?；龠M(jìn)晶狀體老化和白內(nèi)障[5]。

氨甲?；淖兊鞍踪|(zhì)的結(jié)構(gòu)特性，突出的影響是除去了正電荷，它使蛋白質(zhì)與水的相互作用改變，且擾亂了離子對(duì)蛋白質(zhì)表面的相互作用，因?yàn)檫@些相互作用被認(rèn)為可穩(wěn)定蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，它們的喪失導(dǎo)致顯著地構(gòu)象改變。氨甲酰化也干擾蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間的相互作用。例如，I型膠原蛋白的氨甲?；T導(dǎo)它的三級(jí)螺旋結(jié)構(gòu)構(gòu)象改變，降低聚合成正常膠原纖維的能力，這些改變同氨甲?；z原無力刺激中性分葉核粒細(xì)胞的氧化功能有關(guān)[6]。膠原的氨甲?；梢愿淖凅w內(nèi)膠原和炎性細(xì)胞之間的相互作用和干擾細(xì)胞外基質(zhì)正常結(jié)構(gòu)的改變。

Ha等[7]研究了氨甲?；椎鞍?cAlb)對(duì)微小RNA(miRNAs)表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)miR-146a/b的表達(dá)受cAlb顯著地誘導(dǎo)，miR-146a增加12.75倍，miR146b增加5.88倍。由于cAlb刺激，miR-146 a/ b水平增加，P＜0.05。也發(fā)現(xiàn)在腎細(xì)胞癌腫瘤組織中，miR-146a/b表達(dá)水平增加，與相應(yīng)的非腫瘤組織比較，P＜0.05。對(duì)于cAlb的功能進(jìn)一步研究，可以提供對(duì)腎細(xì)胞癌病理生理學(xué)新的洞察力。

3 疾病時(shí)蛋白質(zhì)的氨甲酰化

在體內(nèi)，因?yàn)楫惽杷嵝纬傻耐緩剑奔柞；瘍?yōu)先涉及在2個(gè)病理生理過程：CRF和動(dòng)脈粥樣硬化[8,9]。在CRF時(shí)，慢性尿毒癥刺激LDL氨甲酰化(cLDL)，cLDL是一種潛在的導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化因子。本文主要闡述在CRF時(shí)涉及的病理生理過程。

在CRF時(shí)，氨甲?；悄蚨景Y的一個(gè)后果，也是此病的一個(gè)惡化因素。例如氨甲?；陌椎鞍资窃鲞M(jìn)腎小管損害的一個(gè)原因，及促進(jìn)小管周圍纖維化[10]。而且，氨甲?；难獫{蛋白質(zhì)刺激腎小球增殖以及膠原蛋白合成，因此，有助于腎纖維化。纖維化也能來自于無活性的酶，它涉及結(jié)構(gòu)改變的細(xì)胞外基質(zhì)，及來自不穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)改變的膠原蛋白。的確，氨甲?；T導(dǎo)膠原蛋白三維螺旋構(gòu)象的不穩(wěn)定性，是造成蛋白水解敏感度改變的原因，因?yàn)榘奔柞；哪z原蛋白顯示對(duì)膠原蛋白酶有更大的抵抗性，但是對(duì)明膠酶的敏感度增加[11]。而且，氨甲酰化蛋白質(zhì)可調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞的功能，如氨甲酰化白蛋白對(duì)中性多形核粒細(xì)胞的呼吸爆發(fā)(respiratory burst)作用的抵制效應(yīng)可以說明[12]。呼吸爆發(fā)是指在再灌注期間，組織重新獲得氧供應(yīng)，激活中性粒細(xì)胞耗氧顯著增加，產(chǎn)生大量氧自由基。中性多形核中性粒細(xì)胞氧化功能的這種失調(diào)可以促進(jìn)在尿毒癥病人中所觀察到的炎性及感染性疾病。尿毒癥促成游離氨基酸轉(zhuǎn)變成氨甲?；被?，后者已被證實(shí)為尿毒癥的毒素，因?yàn)樗鼈兏蓴_蛋白質(zhì)的合成及轉(zhuǎn)氨作用，且促成胰島素抵抗。

4 可利用的生物標(biāo)志物及它們與臨床的關(guān)聯(lián)

4.1 氨甲酰化的血紅蛋白(cHb)cHb主要來自異氰酸共價(jià)結(jié)合到珠蛋白β-鏈的N末端纈氨酸殘基上，可達(dá)總Hb的2%。最初認(rèn)識(shí)cHb是在用離子交換層析法測(cè)定HbAlc時(shí)的一種分析干擾物。cHb也構(gòu)成HbAlc形成時(shí)的“病理生理干擾”，因?yàn)楫惽杷嵬咸烟歉?jìng)爭(zhēng)結(jié)合N-末端纈氨酸殘基，尿毒癥病人測(cè)得的HbAlc值應(yīng)小心解釋[13]。cHb通常用HPLC紫外檢測(cè)器檢測(cè)在酸水解得到的N-甲酰纈氨酸的乙內(nèi)酰脲衍生物。cHb濃度的表達(dá)以每克的總Hb中所含纈氨酸乙內(nèi)酰脲(Valine hydantoin, VH)的微克數(shù)表示(μg VH/gHb)，在健康個(gè)體參考范圍為27～38μg VH/gHb；在CRF病人中此值約高5倍。cHb增加同Hb暴露于高濃度尿素的時(shí)間和程度兩者相關(guān)，提示cHb在鑒別急性或慢性腎衰病人時(shí)是一個(gè)有用的生物標(biāo)志物。Tarif等[14]研究了CRF病人透析期間cHb水平的變化，結(jié)果顯示CRF病人cHb水平增加，且同血液尿素濃度呈正相關(guān)，可以更好地反映透析期間尿素濃度的改變，可以用作尿毒癥控制的一個(gè)更準(zhǔn)確的指征。臨床上，良好透析的病人cHb水平應(yīng)低于100μgVH/ gHb。

4.2 cLDL它是人血清中的一種非酶促修飾的LDL，通過尿素自發(fā)分解產(chǎn)生的氰酸鹽誘導(dǎo)LDL氨甲?；纬傻腸LDL，在CRF的病人則顯著增加，可引起心血管并發(fā)癥。目前已發(fā)展了ELISA法測(cè)定血清cLDL濃度[15]。40例健康對(duì)照其濃度為86.1±29.7mg/L，41例終末期腎病血清cLDL濃度則顯著增加，為281.5±46.9mg/L，P＜0.001。此試驗(yàn)簡(jiǎn)單，容易操作，在腎病及健康個(gè)體中對(duì)心血管疾病的研究，是一個(gè)潛在的有價(jià)值的工具。

4.3 蛋白質(zhì)結(jié)合的高瓜氨酸前已述及當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的賴氨酸ε-氨基參與反應(yīng)時(shí)，則形成ε-甲氨酰賴氨酸，也稱之為高瓜氨酸[4]。Mydel等[16]報(bào)告蛋白質(zhì)的翻譯后修飾有可能產(chǎn)生抗原的新表位(neoepitopes)，其后它可能觸發(fā)免疫反應(yīng)。賴氨酸殘基的氨甲?；纬筛吖习彼?，可能是觸發(fā)炎性反應(yīng)的一個(gè)關(guān)鍵機(jī)制。在用鼠模型評(píng)價(jià)觸發(fā)免疫反應(yīng)中氨甲酰化的作用，發(fā)現(xiàn)含有高瓜氨酸肽的鼠，免疫誘導(dǎo)趨化性、T細(xì)胞激活及抗體的產(chǎn)生，鼠也產(chǎn)生侵蝕性關(guān)節(jié)炎。T細(xì)胞反應(yīng)來自高瓜氨酸肽，以及隨后產(chǎn)生的抗高瓜氨酸自身抗體，是誘導(dǎo)自身免疫反應(yīng)的關(guān)鍵?？垢吖习彼犭目贵w對(duì)關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)理提供一個(gè)新的機(jī)制。

5 小結(jié)

上述討論涉及蛋白質(zhì)氨甲?；磻?yīng)的生物化學(xué)及與臨床的關(guān)聯(lián)。因?yàn)榘奔柞；a(chǎn)物的測(cè)定目前尚需高精設(shè)備，有些方法尚未標(biāo)準(zhǔn)化，因此多在研究實(shí)驗(yàn)室使用。然而，大量的證據(jù)表明蛋白質(zhì)和氨基酸的氨甲酰化涉及在多種疾病的發(fā)病機(jī)理及進(jìn)展中，對(duì)于洞察疾病的發(fā)病機(jī)理可以提供新的信息。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，可利用的分析方法不久就會(huì)逐步進(jìn)入臨床應(yīng)用。

[1]Jaisson S,Gillery P.Evaluation of nonenzymatic posttranslational modification-derived products as biomarkers of molecular ageing of proteins[J].Clin Chem,2010,56(9):1401-1412.

[2]Baynes JW.The clinical chemome:a tool for the diagnosis and management of chronic disease[J].Clin Chem 2004,50(7):1116-1117.

[3]Kraus LM,Kraus AP Jr.Carbamoylation of amino acids,and proteins in uremia[J].Kidney Int,2001,78(Suppl):S102-S107.

[4]Wang Z,Nicholls SJ,Rodriguez ER,et al.Protein carbamylation links inflammation,smoking,uremia and atherogenesis[J].Nat Med,2007, 13(10):1176-1184.

[5]Harding JJ.Viewingmolecularmechanisms of ageing through a lens [J].Ageing Res Rev,2002,1(3):465-479.

[6]Jaisson S,Lorimier S,Ricard-Blum S,et al.Impact of carbamylation on type I collagen conformational structure and its ability to activate human polymorphonuclear neutrophils[J].Chem Biol,2006, 13(2):149-159.

[7]Ha E,Bang JH,Son JN,et al.Carbamylated albumin,stimulates microRNA-146,which is increased in human renal cell carcinoma [J].MolMed Report,2010,3(2):275-279.

[8]Apostolov EO,Ray D,Savenka AV,et al.Chronic uremia stimulate LDLCarbamylation and atherosclerosis[J].JAm Soc Nephrol,2010, 21(11):1852-1857.

[9]Sirpal S.Myeloperoxidase-mediated lipoprotein carbamylation as a mechanistic pathway for atherosclerotic vascular disease[J].Clin Sci (Lond),2009,116(9):681-695.

[10]Gross ML,Piecha G,Bierhaus A,et al.Glycated and carbamylated albumin are more“nephrotoxic”than unmodified albumin in the amphibian kidney[J].Am J Physiol Renal Physiol,2011,301(3): F476-F485.

[11]Jaisson S,Larreta-Garde V,Bellon G,et al.Carbamylation differentially alters type I collagen sensitivity to various collagenases[J]. Matrix Biol,2007,26(3):190-196.

[12]Jisson S,Delevallee-Forte C,Toure F,et al.Carbamylated albumin is a potent inhibitor of polymorphonuclear neutrophil respiratory burst[J].FEBSLett,2007,581(7):1509-1513.

[13]Szymezak J,Lavalard E,Martin M,et al.Carbamylated hemoglobin remains a critical issue in HbA1cmeasurements[J].Clin Chem Lab Med,2009,47(5):612-613.

[14]Tarif N,Shaykh M,Stim J,et al.Carbamylated hemoglobin in hemodialysis patients[J].Am JKidney Dis,1997,30(3):361-365.

[15]Apostolov EO,Shah SV,Ok E,et al.Quantification of carbamylated LDL in human sera by a new sandwich ELISA[J].Clin Chem,2005, 51(4):719-728.

[16]Mydel P,Wang Z,Brisslert M,et al.Carbamylation-dependent activalion of T cells:a novelmechanism in the pathogenesis of autoimmune arthritis[J].J Immunol,2010,184(12):6882-6890.

實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)開設(shè)稿件處理“綠色通道”

所有來稿經(jīng)本刊確認(rèn)已正式辦理投稿手續(xù)，本刊即刻啟動(dòng)審稿程序。本刊所有稿件均需三審：編輯初審、專家二審、主編終審。只有三審均通過的稿件才可刊用。本刊審稿周期約為3個(gè)月，對(duì)于可以刊用的稿件，本刊于3個(gè)月內(nèi)通知文章第一作者辦理用稿手續(xù)；對(duì)各類基金資助課題論文，碩士、博士研究生論文，實(shí)行綠色審稿通道，最快可于投稿后30天內(nèi)正式刊發(fā)。作者在接到修稿通知后，請(qǐng)及時(shí)將修改后電子文本發(fā)至本刊電子信箱(應(yīng)注明稿號(hào))。根據(jù)本刊與作者簽署的版權(quán)協(xié)議，本刊對(duì)稿件擁有協(xié)議中的權(quán)利和義務(wù)。對(duì)不用稿件，我刊不予退稿。

《實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)》編輯部

R692.5

A

1674-1129(2013)05-0409-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2013.05.001

王繼貴，男，1937年生，湘雅二醫(yī)院檢驗(yàn)科原主任，主任檢驗(yàn)師，研究方向?yàn)榕R床生物化學(xué)。