史鋒厚，范蓉蓉，周 婷，沈永寶

（南京林業(yè)大學(xué) 森林資源與環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210037）

在植物的常規(guī)育種工作中，人工授粉常需提前采集花粉并貯藏花粉。花粉貯藏可以解決雜交親本花期不遇產(chǎn)生的時(shí)間差問(wèn)題，同時(shí)能解決遠(yuǎn)距離人工輔助授粉的問(wèn)題。花粉活力主要受到植物遺傳特性的制約，但貯藏條件也會(huì)影響花粉的壽命[1-2]。影響花粉貯藏效果的條件主要為貯藏溫度和花粉含水量，且各自的影響效果存在差異[3-6]。海棠為我國(guó)傳統(tǒng)觀賞植物，關(guān)于其花粉貯藏和萌發(fā)的研究報(bào)道并不多見(jiàn)。因此，文中以垂絲海棠Malus halliana為研究對(duì)象，對(duì)其花粉萌發(fā)率進(jìn)行了測(cè)定，分析了不同貯藏條件對(duì)花粉活力的影響情況，以期為垂絲海棠花粉的保存和利用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 花粉采集

2010年4月上旬，在南京林業(yè)大學(xué)校園內(nèi)采集垂絲海棠的花粉。從5株植株中剪取著生花芽較多的枝條約20枝，帶回實(shí)驗(yàn)室水培催花。待花瓣張開(kāi)時(shí)，用鑷子撥出并抖動(dòng)花藥，用硫酸紙收集花粉并將花粉充分混合以待用。

1.2 花粉干燥

花粉干燥采用室內(nèi)自然風(fēng)干法。將收集的花粉均勻平鋪于硫酸紙表面，每隔1 h攪拌1次花粉，促使其中的水分均勻散失。分別風(fēng)干3和6 h后，獲得不同含水量的花粉樣品，以未風(fēng)干的花粉作為對(duì)照。按照高芬等人[1]所用的烘干法測(cè)定花粉含水量。

1.3 花粉貯藏

將不同含水量的花粉分別密封于10 mL的離心管中，并分別置于室溫（25 ℃）、4 ℃、－18 ℃、－38 ℃的冰箱中保存，每隔5 d測(cè)定各處理花粉的萌發(fā)率，持續(xù)測(cè)定30 d。

1.4 花粉萌發(fā)試驗(yàn)

花粉萌發(fā)試驗(yàn)采用瓊脂、蔗糖、硼酸固體培養(yǎng)基。為了優(yōu)選最佳培養(yǎng)基，采用了單因素梯度試驗(yàn)設(shè)計(jì)，各處理所用花粉培養(yǎng)基的具體配方詳見(jiàn)表1。

表1 花粉培養(yǎng)基配方Table 1 Formula of pollen media %

培養(yǎng)時(shí)將花粉均勻地散落在盛有培養(yǎng)基的凹形載玻片上，置于底部帶有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，在25 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)6 h后，置于顯微鏡下觀察花粉萌發(fā)情況，每份樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)觀察3個(gè)視野，以花粉管長(zhǎng)度超過(guò)花粉直徑作為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 蔗糖和硼酸對(duì)花粉萌發(fā)的影響

先以0.6%瓊脂＋不同濃度蔗糖＋1.0%硼酸作為培養(yǎng)基進(jìn)行新鮮花粉的萌發(fā)試驗(yàn)，再以0.6%瓊脂＋10%蔗糖＋不同濃度硼酸為培養(yǎng)基進(jìn)行新鮮花粉萌發(fā)試驗(yàn)，各處理花粉萌發(fā)結(jié)果見(jiàn)表2。由表2 可知，培養(yǎng)基中添加蔗糖對(duì)花粉萌發(fā)的促進(jìn)作用達(dá)極顯著水平（P＜0.01），花粉萌發(fā)率隨著蔗糖濃度的增大呈先上升后下降的變化趨勢(shì)；當(dāng)培養(yǎng)基中的蔗糖濃度為10%時(shí)，花粉萌發(fā)率最高，為對(duì)照的4倍；當(dāng)蔗糖濃度超過(guò)10%時(shí)，花粉萌發(fā)率則顯著下降。

表2 蔗糖和硼酸對(duì)花粉萌發(fā)的影響?Table 2 Effect of sucrose and H3BO3 on pollen germination %

在0.6%瓊脂＋10%蔗糖配方的基礎(chǔ)上，在培養(yǎng)基中添加不同濃度的硼酸進(jìn)行新鮮花粉萌發(fā)試驗(yàn)，各處理的花粉萌發(fā)率亦見(jiàn)表2。培養(yǎng)基中添加硼酸可以極顯著地提高花粉的萌發(fā)率（P＜0.01）；在添加了不同濃度硼酸的培養(yǎng)基后，各處理花粉萌發(fā)率之間的差異達(dá)到了顯著水平。硼酸濃度為2.0%時(shí)，花粉萌發(fā)率高達(dá)81%。綜合分析可知，宜用0.6%瓊脂＋10%蔗糖＋2.0%硼酸的配方培養(yǎng)基作為垂絲海棠花粉萌發(fā)培養(yǎng)基。

2.2 自然干燥對(duì)花粉含水量和活力的影響

在自然干燥過(guò)程中，花粉含水量下降，花粉活力隨之發(fā)生變化（見(jiàn)表3）。經(jīng)不同時(shí)間自然干燥處理后，花粉萌發(fā)率之間的差異達(dá)到了極顯著水平（P＜0.01）。當(dāng)花粉含水量降至10.35%時(shí)，花粉萌發(fā)率下降3個(gè)百分點(diǎn)，即自然干燥3 h后花粉仍能保持較高的活力；而當(dāng)其含水量下降至8.72%時(shí)，花粉活力卻顯著下降，此時(shí)花粉的萌發(fā)率僅為58%。上述結(jié)果說(shuō)明：花粉萌發(fā)率隨其含水量的下降而降低，但當(dāng)含水量的下降幅度不大時(shí)，花粉活力仍能保持較高水平；但自然干燥時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)，花粉萌發(fā)率卻顯著降低。因此，新鮮花粉采集后，應(yīng)防止過(guò)度失水，避免花粉活力明顯下降。

表3 干燥時(shí)間對(duì)海棠花粉活力的影響Table 3 Effect of drying time on pollen vigor in Malus halliana

2.3 不同貯藏條件對(duì)花粉萌發(fā)的影響

將不同含水量的花粉分別貯藏在不同溫度條件下，各處理花粉萌發(fā)率的變化情況如圖1～3所示。對(duì)不同貯藏條件下海棠花粉的萌發(fā)率進(jìn)行方差分析與多重比較，結(jié)果分別見(jiàn)表4與表5。

圖1 新鮮垂絲海棠花粉萌發(fā)率的變化情況Fig.1 Variation of germination rate of fresh pollens in Malus halliana

圖2 干燥3 h后的垂絲海棠花粉萌發(fā)率的變化情況Fig.2 Variation of germination rate of pollens dried for three hours in Malus halliana

圖3 干燥6 h后的垂絲海棠花粉萌發(fā)率的變化情況Fig.3 Variation of germination rate of pollens dried for six hours in Malus halliana

在不同貯藏時(shí)間和貯藏溫度條件下，新鮮花粉的萌發(fā)率隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而呈現(xiàn)出逐漸下降的變化趨勢(shì)（如圖1）；不同貯藏溫度、不同貯藏時(shí)間下花粉萌發(fā)率之間的差異均達(dá)到了極顯著水平，貯藏溫度和時(shí)間之間具有極顯著的交互作用（見(jiàn)表4）。室溫貯藏的花粉其萌發(fā)率下降速度最快，貯藏5 d時(shí)，花粉萌發(fā)率已下降52個(gè)百分點(diǎn)，貯藏15 d時(shí)已完全不能萌發(fā)。貯藏于4 ℃和－18 ℃溫度條件下的花粉其萌發(fā)率具有相同的變化趨勢(shì)；但貯藏于4 ℃溫度條件下的花粉萌發(fā)率其下降幅度更大；貯藏在－38 ℃溫度條件下的花粉，在貯藏前5 天花粉的萌發(fā)率降低了13個(gè)百分點(diǎn)；繼續(xù)貯藏至30 d時(shí)花粉萌發(fā)率的變化不大。

在不同貯藏溫度條件下，含水量為10.35%的花粉其萌發(fā)率的變化情況見(jiàn)圖2。貯藏溫度和貯藏時(shí)間對(duì)花粉萌發(fā)的影響均達(dá)極顯著水平，貯藏溫度和時(shí)間之間具有極顯著的交互作用（見(jiàn)表4）。分別貯藏于室溫和4 ℃條件下的花粉其萌發(fā)率持續(xù)下降；分別貯藏于－18 ℃和－38 ℃條件下的花粉其萌發(fā)率的變化趨勢(shì)基本一致?；ǚ墼谑覝刂匈A藏5 d，其萌發(fā)率降低33個(gè)百分點(diǎn)；貯藏至30 d時(shí)其萌發(fā)率已降至0。在4 ℃貯藏環(huán)境中，花粉萌發(fā)率均勻下降。在－18 ℃和－38 ℃溫度條件下貯藏前10 d，花粉萌發(fā)率的變化情況基本相似；貯藏10 d后，貯藏于－38 ℃條件下的花粉其萌發(fā)率的降幅較小，貯藏至30 d時(shí)其萌發(fā)率仍有67%。

自然干燥6 h后，花粉萌發(fā)率已降至58%，貯藏于各溫度條件下的花粉其萌發(fā)率均呈下降趨勢(shì)（圖3）。不同貯藏溫度之間、不同貯藏時(shí)間之間花粉萌發(fā)率的差異均達(dá)極顯著水平，貯藏溫度和時(shí)間之間具有極顯著的交互作用（表4）。室溫貯藏前10 d，花粉萌發(fā)率持續(xù)下降，室溫貯藏至10 d時(shí)，萌發(fā)率僅為2%。貯藏于－18℃和－38 ℃條件下的花粉其萌發(fā)率的變化趨勢(shì)和變化幅度相似，貯藏至30 d時(shí)萌發(fā)率已分別降至35%和39%。貯藏5 d后，貯藏于4 ℃條件下的花粉其萌發(fā)率降低19個(gè)百分點(diǎn)；而后花粉萌發(fā)率均勻下降，貯藏至30 d時(shí)，花粉萌發(fā)率僅為12%。

表4 不同干燥時(shí)間與不同貯藏條件下花粉萌發(fā)率的方差分析結(jié)果?Table 4 Variance analysis of pollen germination rates dried for different duration under different storage conditions

表5 各處理花粉萌發(fā)率的多重比較結(jié)果Table 5 Multiple comparisons of pollen germination rates in different treatments

3 討論與結(jié)論

3.1 蔗糖和硼酸對(duì)花粉萌發(fā)的影響

花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)是花粉活力檢驗(yàn)的常用方法，具有簡(jiǎn)單、迅速、定量的特點(diǎn)[7]。離體培養(yǎng)基一般由蔗糖、瓊脂和硼酸組成，蔗糖和硼酸的濃度對(duì)花粉萌發(fā)具有不同程度的影響[4，8]。在本實(shí)驗(yàn)中，培養(yǎng)基中添加蔗糖可以顯著促進(jìn)花粉萌發(fā)，這與有關(guān)新疆野蘋(píng)果M.sieversii的研究結(jié)論一致[4]，蔗糖可以為花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)能維持花粉與培養(yǎng)基之間的滲透平衡[9]。垂絲海棠花粉萌發(fā)培養(yǎng)基中蔗糖的最佳濃度為10%，這與樊新民等人[3]和張鮮鮮等人[10]的研究結(jié)論相符。蔗糖具有濃度效應(yīng)，當(dāng)超過(guò)一定濃度時(shí)，其表現(xiàn)出抑制作用[8]，花粉萌發(fā)率反而會(huì)降低，而高濃度蔗糖可引起花粉質(zhì)壁分離，抑制花粉萌發(fā)[11]。

硼酸是花粉萌發(fā)時(shí)必需的微量元素，可以促進(jìn)糖的吸收和代謝，增加氧氣的含量和吸收量，促進(jìn)果膠物質(zhì)的合成，有利于花粉萌發(fā)和建造花粉管[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，培養(yǎng)基中添加硼酸有利于花粉萌發(fā)，促使花粉萌發(fā)的適宜硼酸濃度為1.5%～2.5%，其中濃度為2.0%的硼酸對(duì)花粉萌發(fā)的促進(jìn)效果最佳，這與張鮮鮮等人[10]的研究結(jié)論相似。綜合試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，應(yīng)選擇0.6%瓊脂＋10%蔗糖＋2.0%硼酸的培養(yǎng)基作為垂絲海棠花粉萌發(fā)檢測(cè)的基本培養(yǎng)基。

3.2 花粉貯藏特性

花粉貯藏條件對(duì)于花粉活力的保持具有重要作用，影響花粉壽命的關(guān)鍵因子是花粉含水量和貯藏溫度，一般認(rèn)為，干燥處理、低溫是保存花粉的必要前提[13]。不同花粉貯藏所需的最佳含水量和貯藏溫度存在差異，如室內(nèi)涼干24 h的蘋(píng)果M.domestica花粉在常溫條件下貯藏的時(shí)間不能超過(guò)1周，在－20 ℃條件下貯藏30 d的花粉其萌發(fā)率高于90%[6]；海棠M.spectabilis花粉貯藏效果的溫度條件依次為超低溫（－196 ℃）＞0 ℃＞－20 ℃＞常溫[3]；新疆野蘋(píng)果花粉于4 ℃溫度條件下貯藏的效果較好[4]；銀杏Ginkgo biloba花粉含水量在6.7%～8.9%時(shí)，貯存溫度在6 ℃以下其萌發(fā)率均較高[14]；沙田柚Citrus maximacv.Shatian花粉低溫貯藏的適宜含水量為11.2%～13.5%[15]；蔗茅Erianthus ru fi pilus花粉含水量在低于10%時(shí)才能較長(zhǎng)時(shí)間地保持花粉活力[16]。因此，不同種類(lèi)的花粉在貯藏時(shí)需要尋求其最佳花粉含水量和適宜貯藏溫度范圍。

本實(shí)驗(yàn)中，不同含水量的垂絲海棠花粉貯藏在4種溫度環(huán)境中，各處理花粉萌發(fā)率呈現(xiàn)出不同的下降趨勢(shì)，但各處理花粉萌發(fā)率的變化存在顯著差異，貯藏溫度和花粉含水量對(duì)于花粉活力的保持具有顯著的交互作用。在各含水量梯度內(nèi)，垂絲海棠花粉貯藏能力的排序均為：室溫＜4 ℃＜－18 ℃＜－38 ℃，這與有關(guān)蘋(píng)果混合花粉的研究結(jié)果一致[5]。室溫貯藏不利于花粉活力的保持，花粉在短期貯藏時(shí)間內(nèi)均喪失活力。－38 ℃低溫環(huán)境更有利于花粉活力的保持，其原因在于低溫可抑制物質(zhì)代謝，減弱酶活性，降低呼吸作用[7]。適度降低花粉含水量有利于花粉活力的保持，但花粉失水過(guò)多則會(huì)導(dǎo)致花粉活力快速下降。當(dāng)花粉含水量為10.35%時(shí)，與新鮮花粉相比，花粉仍然具有較高活力，且在適宜的貯藏溫度條件下可以長(zhǎng)時(shí)間保持其較高活力；當(dāng)花粉自然干燥6 h時(shí)，花粉萌發(fā)率顯著下降，花粉活力在貯藏過(guò)程中喪失較快。

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