李鐵柱，杜紅巖，朱高浦

（1.中國林業(yè)科學(xué)研究院 經(jīng)濟(jì)林研究開發(fā)中心，河南 鄭州 450003；2.國家林業(yè)局 杜仲工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450003）

杜仲Eucommia ulmoidesOliv.是我國特有名貴藥用樹種[1]，果實、葉片、樹皮、雄蕊中含有苯丙素類、不飽和脂肪酸、黃酮類、環(huán)烯醚萜類、木質(zhì)素類等活性成分，具有明顯的補肝腎、強(qiáng)筋骨、安胎作用、抗菌消炎、降血壓降血脂等作用，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥保健、食品和化妝品行業(yè)[2]。杜仲葉片中的主要苯丙素類物質(zhì)是綠原酸（Chlorogenic acid）[3-7]。杜仲綠原酸抗菌作用較強(qiáng)，具有降壓、抗菌、消炎、止血、抗氧化等作用，對急性咽喉炎及皮膚病有明顯療效[8]。

綠原酸（Chlorogenic acid）是由咖啡酸（Caffeic acid）與奎尼酸（Quinic acid，QA）組成的縮酚酸[9-10]，異名咖啡單寧酸，又咖啡鞣酸，化學(xué)名為5-O-咖啡酰奎尼酸（5-O-caffeoylqulnic acid），分子式為C16H18O9，相對分子質(zhì)量為354.30。它是植物在有氧呼吸過程中經(jīng)磷酸戊糖途徑中間產(chǎn)物合成的一種苯丙素類物質(zhì)[11]。綠原酸生物合成途徑見圖1。

圖1 綠原酸合成途徑Fig.1 The pathway of chlorogenic acid biosynthesis

咖啡?；诳崴嵘系慕Y(jié)合部位和數(shù)目有所不同，從理論上講，單咖啡酰奎尼酸和二咖啡?？崴崴行纬傻木G原酸共有10種異構(gòu)體，但到目前為止，從植物中發(fā)現(xiàn)的綠原酸異構(gòu)體有7種，即綠原酸（5-O-咖啡?？崴幔㈦[綠原酸（4-咖啡?？崴幔?、新綠原酸（3-咖啡酰奎尼酸）、異綠原酸A（4,5-二咖啡酰奎尼酸）、異綠原酸B（3,5-二咖啡酰奎尼酸）、異綠原酸C（3,4-二咖啡酰奎尼酸）、萊薊素（l,3-二咖啡酰奎尼酸）。

1 材料與方法

分別于2010年5月28日和10月28日，在國家林業(yè)局泡桐研究開發(fā)中心采集“華仲6號”杜仲優(yōu)良品種葉片和果實，提取RNA，送至深圳華大基因公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序和基因功能注釋[12-13]。

轉(zhuǎn)錄組測序得到的Unigene，利用NCBI網(wǎng)站上的BLAST工具，和其它物種已知的CDS序列進(jìn)行在線比較，用相似性得分比較高的已知基因確定并命名杜仲轉(zhuǎn)錄組中的待分析基因。確定基因后，分析該基因（或基因家族）在杜仲葉片和果實中的表達(dá)量，推斷該基因在杜仲活性成分生物合成中的地位和作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 杜仲轉(zhuǎn)錄組中綠原酸生物合成途徑中被注釋的Unigene基因

在杜仲葉片和果實轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中共3個步驟、4個基因被KEGG數(shù)據(jù)庫綠原酸合成途徑注釋（見圖2）。苯丙氨酸脫氨酶（phenylalanin ammonia-lyase，PAL）注釋Unigene9151等3條Unigene，其中果實和葉片差異表達(dá)的基因有1條；肉桂酸-4-羥化酶（cinnamate 4-hydroxylase，C4H）注釋Unigene9197等9條Unigene，其中差異表達(dá)基因有4條；香豆酸-CoA連接酶（4CL）注釋Unigene6686等24條Unigene，其中差異表達(dá)基因有13條；莽草酸羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶（shikimate hydroxycinnamoyl transferase，HCT） 注 釋Unigene24848等43條Unigene，其中差異表達(dá)基因有20條。

2.2 杜仲葉片和果實綠原酸合成途徑系列基因的確定

經(jīng)過進(jìn)一步BLAST分析發(fā)現(xiàn)，Unigene9151、Unigene3306、Unigene8123等13條Unigene與長春花、咖啡等植物種的PAL基因相似性達(dá)到77%～99%（見表1）。其中Unigene9151為PAL基因全長cDNA；Unigene9197、Unigene27913等2條Unigene與煙草等植物種的肉桂酸-4-羥化酶相似性達(dá)到77%～90%，為C4H基因全長cDNA；Unigene6686、Unigene14128等11條Unigene與楊樹、白樺等植物種的4CL基因相似性達(dá)到66%～92%；Unigene24848、Unigene6511與咖啡等植物種的HCT基因相似性分別達(dá)到56%和54%，其中Unigene24848為全長cDNA。

2.3 杜仲綠原酸相關(guān)基因多樣性及表達(dá)差異

2.3.1 杜仲EuPAL基因的多樣性及表達(dá)差異

苯丙氨酸脫氫酶（PAL）是綠原酸合成途徑中的關(guān)鍵酶[14-15]，杜仲的果實和葉片組織中PAL的多態(tài)性非常高，PAL基因家族高達(dá)至少12個成員，分別命名為EuPAL1～EuPAL12，其中Unigene9151即EuPAL1為全長cDNA（見表2）。

杜仲果實和葉片的轉(zhuǎn)錄組分析表明，杜仲苯丙氨酸脫氫酶EuPAL1～EuPAL12（Unigene15537～Unigene81458）12個基因在葉片和果實中均有表達(dá)，但EuPAL3～EuPAL12（Unigene15537～Unigene8123）的表達(dá)量存在顯著差異（見表3）。其中表達(dá)量最高的EuPAL3（Unigene46841）和 最 低 的EuPAL12（Unigene38418）在果實的表達(dá)量分別比葉片高29.22倍和19.02倍（見圖3），而EuPAL1（Unigene9151） 和EuPAL12（Unigene18458），在果實和葉片的表達(dá)量未達(dá)到顯著水平。

圖2 KEGG數(shù)據(jù)庫中的綠原酸生物合成Fig.2 The KEGG pathway of chlorogenic acid biosynthesis

表1 綠原酸合成途徑中相關(guān)酶基因和對應(yīng)Unigene相似度信息Table 1 Information of similarity between gene and Unigene in chlorogenic acid synthesis pathway

表2 杜仲葉片和果實EuPAL基因多樣性Table 2 Genetic diversity of EuPAL

表3 苯丙氨酸脫氫酶相關(guān)基因在杜仲葉片和果實中的表達(dá)多樣性Table 3 Expression of Unigene related in EuPAL in leaves and young fruits

圖3 苯丙氨酸脫氫酶相關(guān)Unigene在杜仲葉片和果實中的表達(dá)差異Fig.3 Expression difference of related EuPAL Unigene related in leaf and fruit

葉片的PAL基因的表達(dá)量最高為EuPAL1（Unigene9151），其次為EuPAL12（Unigene81458），推測杜仲葉片中綠原酸合成的主要的苯丙氨酸脫氫酶為EuPAL1和EuPAL2。果實PAL基因按照表達(dá)量由大到小的順序排列依次為EuPAL3、EuPAL4、EuPAL5、EuPAL6、EuPAL7、EuPAL8、EuPAL9、EuPAL10、EuPAL11、EuPAL1、EuPAL12、EuPAL2。杜仲葉片以EuPAL1和EuPAL2為主，而果實中PAL基因的遺傳多樣性比葉子高很多，基因表達(dá)量也高很多，表達(dá)調(diào)控模式極其復(fù)雜。

2.3.2 EuC4H基因的多樣性和表達(dá)差異

肉桂酸-4-羥化酶（C4H）基因拷貝數(shù)在不同植物種是不同的，如苜蓿有2個，豌豆有1個，綠豆和長春花中多個拷貝的小基因家族形式存在[15-17]。從表4可以看出，杜仲的果實和葉片組織中獲得2個全長C4H基因（Unigene9197和Unigene27913），分別命名為EuC4H1和EuC4H2。

表4 杜仲肉桂酸-4-羥化酶基因的多樣性Table 4 Diversity of EuC4H genes

歐芹種子C4H表達(dá)模式研究結(jié)果顯示，該酶在微管束發(fā)達(dá)的花梗中表達(dá)豐富，在幼葉和老葉中不表達(dá)，擬南芥種C4H基因于正在木質(zhì)化的細(xì)胞中表達(dá)最強(qiáng)[18-19]。杜仲的果實和葉片中EuC4H1（Unigene9197）和EuC4H2（Unigene27913）基因均有表達(dá)，且表達(dá)量存在著顯著差異（見表5），EuC4H1和EuC4H2在果實中的表達(dá)量分別比葉片高出105.25倍和6.32倍（見圖4）。葉片中EuC4H1的表達(dá)量較高，但EuC4H2表達(dá)量接近零，推測葉片綠原酸合成途徑中主要起作用的是EuC4H1基因。無論在果實還是在葉片中EuC4H1的表達(dá)量均比EuC4H2高，故果實也以EuC4H1為主。

表5 EuC4H基因在杜仲葉片和果實中的表達(dá)多樣性Table 5 Expression diversity of EuC4H in leaf and fruit

圖4 EuC4H基因在杜仲葉片和果實中的表達(dá)差異Fig.4 Expression difference of EuC4H in leaf and fruit

2.3.3 Eu4CL基因的多樣性及表達(dá)差異

擬南芥中4CL基因家族有4個成員，煙草有2個成員，大豆有4個成員，顫楊有2個成員，復(fù)盆子有3個成員[20-22]。杜仲的果實和葉片中獲得了11個4CL家族成員，分別命名為Eu4CL1～Eu4CL11（見表6）。

11個杜仲香豆酰-CoA連接酶中Eu4CL2（Unigene14857）、Eu4CL3（Unigene6686）、Eu4CL7（Unigene18613）等3個Eu4CL基因在果實和葉片的表達(dá)未達(dá)到顯著差異（見表7）；而Eu4CL1（Unigene14128）、Eu4CL4（Unigene48688）、Eu4CL5（Unigene29944）、Eu4CL6（Unigene45667）、Eu4CL8（Unigene28080） 等 5個Eu4CL在 果 實和葉片中的表達(dá)具有顯著差異，而且在幼果中均比葉片中表達(dá)量高，表達(dá)量最大的Eu4CL4基因比葉片高出35.04倍（見表7和圖5）；Eu4CL9（Unigene40135）、Eu4CL10（Unigene23597）、Eu4CL11（Unigene22350）在果實中特異表達(dá)，但表達(dá)量較低。按照Eu4CL在果實中表達(dá)量由大到小的順序排列依次為：Eu4CL4、Eu4CL6、Eu4CL5、Eu4CL1、Eu4CL2、Eu4CL3、Eu4CL7、Eu4CL8、Eu4CL11、Eu4CL9、Eu4CL10； 按 照Eu4CL在葉片中表達(dá)量由大到小的順序排列依次 為：Eu4CL2、Eu4CL3、Eu4CL6、Eu4CL4、Eu4CL5、Eu4CL1、Eu4CL7、Eu4CL8。幼果和葉片中Eu4CL～Eu4CL6等基因大量表達(dá)，表達(dá)調(diào)控規(guī)律極其復(fù)雜。

表6 杜仲4CL基因多樣性Table 6 Diversity of Eu4CL genes

表7 香豆酰-CoA連接酶相關(guān)Unigene在杜仲葉片和果實中的表達(dá)多樣性Table 7 Expression diversity of related Eu4CL Unigene in leaf and fruit

圖5 香豆酰-CoA連接酶相關(guān)Unigene在杜仲葉片和果實中的表達(dá)差異Fig.5 Expression difference of related Eu4CL Unigene in leaf and fruit

2.3.4 EuHCT基因的多樣性和表達(dá)差異

莽草酸羥基肉桂酸酰轉(zhuǎn)移酶是綠原酸合成途徑中的限速酶[23-24]。杜仲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲得了3個莽草酸羥基肉桂酸酰轉(zhuǎn)移酶基因家族3個成員，分別命名為EuHCT1～EuHCT3（見表8）。

3個EuHCT基因家族成員在葉片和果實中均有表達(dá)，但僅有EuHCT1在果實和葉片中表達(dá)量有顯著差異，且在果實中的表達(dá)量比葉片高出25.44倍（見表9和圖6）；而EuHCT2和EuHCT3在果實和葉片中的表達(dá)量無顯著差異。按照在果實中表達(dá)量由大到小的順序排列依次為EuHCT1、EuHCT2、EuHCT3； 按 照 葉 片 中的表達(dá)量由大到小的順序排列依次為EuHCT2、EuHCT1、EuHCT3。杜仲幼果以EuHCT1、葉片以EuHCT2為主。

表8 杜仲莽草酸羥基肉桂酸酰轉(zhuǎn)移酶基因多樣性Table 8 Diversity of EuHCT genes

表9 莽草酸羥基肉桂酸酰轉(zhuǎn)移酶相關(guān)Unigene在杜仲葉片和果實中的表達(dá)量Table 9 Expression of related HCT Unigene in leaf and fruit

3 結(jié)論與討論

杜仲苯丙素類物質(zhì)廣泛存在于杜仲根皮、莖皮、綠葉、果實中,包括綠原酸、咖啡酸、松柏酸、松柏苷、丁香苷、香草酸等11種化合物。本研究中發(fā)現(xiàn)的各相關(guān)基因及基因家族，其中哪些基因家族成員專營合成綠原酸，或者哪些基因在綠原酸合成中起最關(guān)鍵作用，這些問題都有待進(jìn)一步分析。

苯丙氨酸解氨酶是杜仲綠原酸合成途徑中的上游的關(guān)鍵酶，本研究從杜仲葉片和果實的轉(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)了12個PAL基因，說明杜仲該基因的遺傳多樣性非常高，超過一般植物。杜仲器官組織中的綠原酸含量，還隨著時間季節(jié)的變化而變化[25]，本研究采集的樣品是5月份和10月份的，杜仲PAL基因及其它基因是否也有時間上的多態(tài)性。

另外，在不同的杜仲品種之間，綠原酸等活性成分含量也不一樣[26]，在其它品種中，PAL等基因的表達(dá)規(guī)律是否和“華仲6號”一致還有待進(jìn)一步探討。不同栽培模式對杜仲葉片及枝、皮等器官中的活性成分的含量也有較大影響[27]，從分子層次來看，是否對PAL等基因的表達(dá)調(diào)控也會造成影響，還需要進(jìn)一步分析。

圖6 HCT相關(guān)Unigene在杜仲葉片和果實中的表達(dá)差異Fig.6 Expression difference of related HCT Unigene in leaf and fruit

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