馮 倩，鄧德耀，周林華，陳 弟，李增安，支國華，薛云松 (云南省第二人民醫(yī)院檢驗科，云南 昆明 650021)

血清低密度脂蛋白膽固醇(LDL－C)檢測作為反映缺血性心血管病發(fā)病危險的指標(biāo)已在臨床被廣泛應(yīng)用，《中國成人血脂異常防治指南》明確規(guī)定不同危險因素存在情況下LDL－C的控制目標(biāo)。目前，檢測LDL－C的參考方法是超速離心法，直接測定方法即均相測定法因其具有簡便、快速、易于自動化，所以作為常規(guī)方法在臨床廣泛應(yīng)用，但有關(guān)的性能評價報道較少。為了深入了解在全自動生化分析儀上檢測LDLC的性能，筆者參考美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(CLSI)的相關(guān)文件、國內(nèi)一些定量檢測性能評價的報道以及試劑廠家的標(biāo)準(zhǔn)，在全自動生化分析儀上對試劑進(jìn)行了性能評價。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器:日立7600全自動生化分析儀。

1.1.2 試劑:①日本積水醫(yī)療株式會社LDL－C檢測試劑(批號:807RLI);②配套校準(zhǔn)品(批號:823RJI);③Bio－Rad質(zhì)控血清水平2(批號46452)和水平3(批號46453);④干擾材料(日本Sysmex公司)，包括游離膽紅素、結(jié)合膽紅素、血紅蛋白和乳糜物。

1.1.3 標(biāo)本:所有受檢者均隔夜空腹8 h以上抽血，3 500 r/min離心5 min，取血清檢測，或留取血清標(biāo)本置于－20℃待檢。

1.2 方法

1.2.1 精密度(precision)驗證:用兩個水平的質(zhì)控品和患者新鮮混合血清按標(biāo)本檢驗程序進(jìn)行測定，在批內(nèi)重復(fù)測定20次，以及每份樣本每天測定1次，連續(xù)測定20天。分別計算批內(nèi)及天間均值標(biāo)準(zhǔn)差(SD)和變異系數(shù)(CV)。并判斷是否小于廠家規(guī)定的性能標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 正確度(accuracy)驗證:依據(jù)參考文獻(xiàn)［1］，結(jié)合筆者科室的實際情況，選擇衛(wèi)生部臨床檢驗中心2012年5月發(fā)放的5個批號的質(zhì)控品進(jìn)行檢測，每個質(zhì)控品測定LDL－C 2次，計算檢測均值與靶值的相對偏倚(%)，偏差小于衛(wèi)生部臨檢中心組織的室間質(zhì)評的允許偏倚，則正確度驗證成功。

1.2.3 分析干擾實驗:采用Sysmex干擾檢查試劑盒。空白液與新鮮混合血清按1:9比例制備各自干擾物的空白對照A液。將結(jié)合膽紅素、血紅蛋白、游離膽紅素和乳糜物用蒸餾水溶解，按1:9的比例分別加入相同的新鮮混合血清，制成不同的干擾物B液，制成后結(jié)合膽紅素B液濃度為20 mg/dl，血紅

蛋白B液500 mg/dl，游離膽紅素B液21 mg/dl，乳糜物B液3000 FTU。將A液與B液按照10∶0(空白管)，8∶2(1號管)，6∶4(2號管)，4∶6(3號管)，2∶8(4號管)，0∶10(5號管)比例混合，制備成空白管及含不同干擾物濃度的1－5號管。對每一份樣品進(jìn)行2次LDL－C濃度測定，結(jié)果取平均值。計算影響度(F)=(含干擾物質(zhì)標(biāo)本檢測值一無干擾物質(zhì)標(biāo)本(空白)檢測值)/無干擾物質(zhì)標(biāo)本檢測值×100%［2］。F絕對值＞10%認(rèn)為該濃度干擾物質(zhì)對LDL－C檢測有影響。

1.2.4 分析測量范圍(analyticaimeasurement range，AMR)驗證:按參考文獻(xiàn)［3－5］，使用廠家提供的高值質(zhì)控品(其值大于廠家給定的分析測量范圍上限)，用生理鹽水稀釋。稀釋液(L)與高值樣本(H)按照10L、9L+1H、8 L+2 H、7L+3 H、6L +4 H、5L+5 H、4 L十6 H、3 L+7H、2 L+8 H、1L+9 H、10H的關(guān)系配制，形成系列濃度樣品。每個濃度重復(fù)測定2次，以平均值為實測值，按照公式預(yù)期濃度=(CL×VL+CH×VH)/ (VL+VH)計算預(yù)期值。將實測值與預(yù)期值作比較，確定LDL－C的分析測量范圍。檢測低限(LLD)的確定:LLD為樣品單次檢測，可以達(dá)到的非空白檢測響應(yīng)量對應(yīng)的分析物的量。按99.7%的可信限，生理鹽水在批內(nèi)重復(fù)測定10次空白樣品±3s所對應(yīng)的LDL－C的量即為LLD。

1.2.5 生物參考區(qū)間(biological reference interval)的驗證:參考CLSIC28－A2文件［6］，選取健康體檢者20例，年齡20～56歲，平均36歲。男女各一半。按照標(biāo)準(zhǔn)操作程序進(jìn)行檢測，對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計并與設(shè)定的參考區(qū)間進(jìn)行比較，若20份標(biāo)本的檢測結(jié)果均在設(shè)定的參考區(qū)間內(nèi)或不超過2份標(biāo)本超出，則驗證通過。否則，進(jìn)行參考區(qū)間確立實驗。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理:應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。分析測量范圍的驗證中截距a與0的比較用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 精密度驗證結(jié)果:批內(nèi)CV均＜5%，天間CV均小于10%，達(dá)到廠家性能標(biāo)準(zhǔn)，見表1。

表1 日立7600全自動生化分析儀測定LDL－C的批內(nèi)、天間不精密度結(jié)果

2.2 正確度驗證結(jié)果:相對偏倚均＜30%，小于衛(wèi)生部臨檢中心規(guī)定的室間質(zhì)評允許偏倚，見表2。

2.3 分析干擾實驗結(jié)果:不同濃度游離膽紅素、結(jié)合膽紅素、血紅蛋白和乳糜物對LDL－C檢測的干擾(F)的絕對值都＜10%，見表3。

表2 日立7600全自動生化分析儀測定LDL－C的偏倚結(jié)果

表3 不同濃度干擾物質(zhì)對LDL－C檢測的干擾(F)

2.4 分析測量范圍驗證結(jié)果:以實測值為Y軸、預(yù)期值為X軸，將結(jié)果點在X－Y坐標(biāo)圖上，計算回歸方程y=bx+a。得到回歸方程y=0.982x－0.05，r=0.999，相關(guān)系數(shù)r≥0.975，b在0.97～1.03范圍內(nèi)，a與0無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，可判斷AMR在實驗已涉及濃度。生理鹽水在批內(nèi)重復(fù)測定10次，結(jié)果均為0，本檢測系統(tǒng)的LLD是0 mmol/L。結(jié)合LLD，本方法的AMR為0～14.38 mmol/L。

2.5 生物參考區(qū)間驗證結(jié)果:20份表面健康人血清LDL－C檢測結(jié)果濃度在0.21～2.36 mmol/L范圍，均在設(shè)定的參考區(qū)間＜3.63 mmol/L范圍之內(nèi)。

3 討論

LDL－C檢測的參考方法是超速離心法，需要特殊的儀器，操作時間長，臨床很難開展，應(yīng)用Friedewald公式計算LDL－C的方法，常受TC、TG和HDL－C變異的影響［7］，所以臨床LDL－C檢測的常規(guī)方法為均相測定法。本檢測系統(tǒng)試劑的檢測原理是均相測定－表面活性劑清除法，試劑1中的表面活性劑1能改變LDL以外的脂蛋白(HDL、CM和VLDL等)結(jié)構(gòu)并解離，所釋放出來的微?；懝檀挤肿优c膽固醇酶試劑反應(yīng)，產(chǎn)生的H2O2在缺乏偶聯(lián)劑時被消耗而不顯色，此時LDL顆粒仍是完整的。加試劑2它可使LDL顆粒解離釋放膽固醇，參與Trinder反應(yīng)而顯色，因其他脂蛋白的膽固醇分子已除去，色澤深淺與LDL－C量呈比例。臨床實驗室的管理部門和相關(guān)機(jī)構(gòu)要求實驗室要選擇適當(dāng)?shù)姆椒▽z測系統(tǒng)的分析性能進(jìn)行評價，證實其能夠達(dá)到所要求的性能標(biāo)準(zhǔn)，才可將分析系統(tǒng)用于常規(guī)工作。本文對日立7600全自動生化分析儀測定LDL－C的主要分析性能進(jìn)行評價，包括不精密度、不準(zhǔn)確度、分析測量范圍、分析干擾試驗、生物參考區(qū)間來了解該系統(tǒng)的性能。

一個檢測系統(tǒng)最基本的性能指標(biāo)是精密度，在本檢測系統(tǒng)，兩個質(zhì)控品及患者混合血清的批內(nèi)、天間變異都小于廠家聲明的CV值。正確度的驗證，有關(guān)文件建議可以通過與參考方法比對或檢測定值參考物(包括由參考方法或決定性方法定值的樣本，從能力比對試驗獲得的參考物，廠家提供的正確度參考物或質(zhì)控物，室間質(zhì)量評價樣本、由第三方提供的已用一些不同方法定值的物質(zhì))來驗證［8］。本實驗使用衛(wèi)生部臨檢中心發(fā)放的5個不同批號的質(zhì)控品進(jìn)行正確度驗證，結(jié)果均小于衛(wèi)生部臨檢中心規(guī)定的室間質(zhì)評允許偏倚。不同濃度的游離膽紅素、結(jié)合膽紅素、血紅蛋白和乳糜物對檢測結(jié)果的影響度均＜10%，可認(rèn)為這些濃度的干擾物質(zhì)不影響LDL－C的檢測。本檢測系統(tǒng)分析測量范圍為0～14.38 mmol/L，略寬于廠商給出的線性范圍(0.04～11.64 mmol/L)。20份健康人血清濃度均在設(shè)定的參考區(qū)間＞3.63 mmol/L范圍內(nèi)，可以認(rèn)為現(xiàn)用參考區(qū)間適用于本實驗室。

總之，本文參考試劑廠家、CLSI文件以及國內(nèi)關(guān)于定量檢測分析系統(tǒng)性能評價的相關(guān)報道，評價了循環(huán)酶法在全自動生化分析儀上檢測LDL－C的性能，基本與廠家申明的性能一致，該檢測系統(tǒng)能夠用于臨床，使用中要注意內(nèi)源性干擾對檢測結(jié)果的影響。

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