許 翠，高夢(mèng)祥 （長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州434025）

微生物具有獨(dú)特和高效的生物轉(zhuǎn)化能力，能產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物，其產(chǎn)物中的一些生物活性物質(zhì) （如抗生素、氨基酸、糖肽等）在醫(yī)藥、食品和化工工業(yè)中有著不可取代的地位［1］。然而，通常從自然界分離得到的野生菌株代謝產(chǎn)物產(chǎn)量往往很低，遠(yuǎn)不能滿足工業(yè)生產(chǎn)的需要，因此微生物應(yīng)用的難題集中到如何對(duì)菌種進(jìn)行改良，以獲得高產(chǎn)高效的優(yōu)良工業(yè)菌株。而微生物育種的目的就是要人為地使某些代謝產(chǎn)物過(guò)量積累，把生物合成的代謝途徑朝著人們所希望的方向加以引導(dǎo)，獲得所需要的高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和低耗的菌種［2］，以降低生產(chǎn)成本［3］。微生物誘變處理一般采取物理誘變方法，如紫外線 （UV）、X射線等和化學(xué)誘變方法如堿基類(lèi)似物、烷化劑甲基磺酸乙酯 （EMS）等傳統(tǒng)方法。但是，這些方法具有耗時(shí)、費(fèi)力、工作量大以及誘變結(jié)果不具定向性等缺點(diǎn)。隨著生命科學(xué)技術(shù)的發(fā)展以及學(xué)科交叉的深入，基因工程、原生質(zhì)體融合和生物信息學(xué)等的應(yīng)用日益廣泛，使得菌種改良技術(shù)得到了不斷的發(fā)展和創(chuàng)新，從而為篩選得到更多優(yōu)質(zhì)、高效菌種提供了技術(shù)上的可能和便利［4］。為此，筆者綜述了近年來(lái)國(guó)內(nèi)外出現(xiàn)的微生物菌種誘變新技術(shù)以及新的篩選方法在微生物菌株選育中的應(yīng)用，旨在為微生物菌種誘變篩選等相關(guān)研究提供啟迪和參考。

1 誘變育種技術(shù)

1．1 離子注入誘變育種

離子注入誘變是集物理誘變、化學(xué)誘變?yōu)橐惑w的綜合誘變方法，1986年由中科院等離子體所率先將低能離子束技術(shù)應(yīng)用于誘變育種［5］。該技術(shù)是利用離子注入設(shè)備對(duì)生物體進(jìn)行離子注入，注入的離子對(duì)細(xì)胞的刻蝕可使細(xì)胞由表及里形成微孔或洞，生物分子吸收能量并引起多類(lèi)活性自由基的復(fù)雜變化，從而引起染色體的畸變，導(dǎo)致DNA鏈堿基的損傷、斷裂［6］，最終導(dǎo)致遺傳物質(zhì)的永久改變，然后從變異菌株中選育優(yōu)良菌株。該技術(shù)應(yīng)用于微生物誘變育種時(shí)具有損傷輕、突變率高、突變譜廣、變異幅度大、性狀穩(wěn)定等特點(diǎn)［7］，其所選用的離子一般為氣體單質(zhì)的正離子，其中以N＋最多，近年來(lái)在工業(yè)微生物優(yōu)良株的誘變選育或改良中取得了較大的成功。李穎穎等［8］對(duì)新鮮靈芝孢子進(jìn)行低能N＋注入，篩選到了1株靈芝高產(chǎn)菌株GL1026，其靈芝子實(shí)體產(chǎn)量、多糖含量、三萜含量分別較對(duì)照菌株提高了15．94%、9．68%、17．60%。王瑤函等［9］以鏈霉菌NJWGH1322為研究對(duì)象，利用N＋低能離子注入、亞硝酸鈉 （NaNO2）進(jìn)行誘變，最終篩選出1株產(chǎn)量突變提高43．1%的高產(chǎn)菌株，經(jīng)5次傳代試驗(yàn)表明該菌株遺傳穩(wěn)定性較好。陳麗娟等［10］以青貯玉米中選育獲得的植物乳桿菌ANCLA01作為出發(fā)菌株，采用單粒子精確定位注入技術(shù)對(duì)其進(jìn)行氮離子注入，篩選獲得正向突變菌株ANCLA02，氮離子的注入使植物乳酸桿菌的共軛亞油酸 （CLA）產(chǎn)量從33．44μg／ml提高到66．67μg／ml，且變異菌株經(jīng)傳5代培養(yǎng)后產(chǎn)CLA穩(wěn)定。

1．2 原生質(zhì)體融合育種

原生質(zhì)體融合技術(shù) （Protoplast fusion）是起源于20世紀(jì)60年代的一項(xiàng)重要的菌種改良技術(shù)，是將親株細(xì)胞分別去除細(xì)胞壁后在高滲條件下輔以物理、化學(xué)或生物手段進(jìn)行融合，經(jīng)基因組間的交換重組，獲得融合子的過(guò)程［11］。原生質(zhì)體融合可以使親本細(xì)胞隨機(jī)融合，有效地篩選具有親本特性的優(yōu)良融合菌株，為遺傳育種提供了一種有效手段，已廣泛應(yīng)用于微生物育種工作的各個(gè)方面 （如高產(chǎn)菌株選育，多功能菌株選育等）。Xu等［12］以始旋鏈霉菌 （S．pristinaespira lis）CGMCC0957突變菌中普納霉素產(chǎn)量最高的4株菌為親本進(jìn)行原生質(zhì)體融合，得到的優(yōu)良菌株的普納霉素產(chǎn)量達(dá)到0．89g／L，比親本高89．4%。Jin等［13］以10株產(chǎn)量較高的多殺菌素產(chǎn)生菌 （Saccharopolyspora spinosa）為出發(fā)菌株，經(jīng)過(guò)融合，得到高產(chǎn)菌株4～7株，其產(chǎn)量可達(dá)到547mg／L，較出發(fā)菌株提高了200．55%以上，在5L發(fā)酵罐中發(fā)酵168h，多殺菌素產(chǎn)量可達(dá)到428mg／L。張歡等［14］以釀酒酵母Y518為出發(fā)菌種，基于多親本原生質(zhì)體融合技術(shù)，通過(guò)4輪原生質(zhì)體融合，得到2株GSH產(chǎn)量提高的釀酒酵母突變菌株，最高產(chǎn)量可達(dá)15．92mg／g，為原始菌株的2倍。張禹等［15］選取具有草酸分解能力的乳雙歧桿菌和具有耐氧特性的嗜酸乳桿菌作為親本，通過(guò)雙親滅活進(jìn)行原生質(zhì)體融合，融合率可達(dá)7．6%。從中篩選出同時(shí)具有耐氧特性和草酸分解能力的融合子，草酸分解率為13．4%。

1．3 基因工程誘變育種

基因工程育種是在分子水平上對(duì)基因進(jìn)行操作，人為將所需的某一供體生物的遺傳物質(zhì)提取出來(lái)，在離體條件下用適當(dāng)?shù)墓ぞ呙高M(jìn)行切割后，與載體連接，然后導(dǎo)入另一細(xì)胞，使外源遺傳物質(zhì)在其中進(jìn)行正常復(fù)制和表達(dá)［16］，從而獲得新物種的一種嶄新技術(shù)。該技術(shù)克服了傳統(tǒng)育種技術(shù)的隨機(jī)性和盲目性，可以完全突破物種間的障礙，進(jìn)行定向變異和育種，在微生物菌種改良方面具有廣闊的應(yīng)用前景。近年來(lái)，隨著基因工程和現(xiàn)代分子生物技術(shù)的快速發(fā)展與突破，基因組改組技術(shù)、基因敲除技術(shù)等新方法的應(yīng)用也日益廣泛。

基因組改組技術(shù)又叫基因組重排 （genome shuffling）是近幾年發(fā)展起來(lái)的一種新型微生物體內(nèi)分子育種方法，其通過(guò)傳統(tǒng)微生物誘變育種與原生質(zhì)體融合技術(shù)的有效結(jié)合，使得不同菌株的全基因組進(jìn)行隨機(jī)重組，進(jìn)而極大提高菌種的正突變頻率，使得人們能夠在短時(shí)間內(nèi)選育到理想菌株［17－18］。該技術(shù)應(yīng)用時(shí)無(wú)需事先了解親本菌株詳細(xì)的遺傳背景即可實(shí)現(xiàn)微生物的定向進(jìn)化［19］，使之成為了一種極其高效的微生物育種手段。王景會(huì)等［20］以4株誘變的枯草芽孢桿菌菌株為親本，采用PEG介導(dǎo)的方法進(jìn)行兩次多親本的全基因組改組，共篩選出3株酶活力大幅度提高并能穩(wěn)定遺傳的優(yōu)良菌株，酶活力最高2175．81U／m L，達(dá)到原始菌株的3．01倍。王大紅等［21］以纖維堆囊菌AHB125為原始菌株，以經(jīng)過(guò)紫外誘變和2%乙酸鈉抗性篩選出來(lái)的SC4－14和SC4－56為出發(fā)菌株，通過(guò)4輪基因組重排成功選育出了5株遺傳穩(wěn)定的埃坡霉素B（Epothilone B）高產(chǎn)菌株，其中1株重排菌株F4－28埃坡霉素B產(chǎn)量達(dá)到67．4mg／L，是原始菌株產(chǎn)量的8倍，是兩親本菌株埃坡霉素B產(chǎn)量的4～5倍。

基因敲除 （gene knockout）是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)重要的分子生物學(xué)技術(shù)，其利用DNA轉(zhuǎn)化技術(shù)，將含有目的基因和靶基因同源片段的重組載體導(dǎo)入靶細(xì)胞，通過(guò)載體與靶細(xì)胞染色體上同源序列間的重組，將外源基因整合入內(nèi)源基因組內(nèi)，使外源基因得以表達(dá)［22］。隨著對(duì)微生物代謝機(jī)理認(rèn)識(shí)的不斷加深，利用基因敲除技術(shù)可阻斷微生物細(xì)胞的代謝旁路，進(jìn)行微生物基因的結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)研究，或通過(guò)引入突變位點(diǎn)降低或阻斷副產(chǎn)物的合成，提高產(chǎn)物的純度，從而改變目的產(chǎn)物的產(chǎn)量或質(zhì)量，改良工業(yè)生產(chǎn)菌株，達(dá)到微生物育種的目的［23］。佐一含等［24］通過(guò)敲除啤酒酵母中β－丙基蘋(píng)果酸脫氫酶基因 （LEU2），篩選獲得的突變株發(fā)酵液中高級(jí)醇含量比出發(fā)菌株降低了9．97%，其中異戊醇的含量降低了11．82%，而酒精度、發(fā)酵速度等發(fā)酵性能沒(méi)有明顯變化。Steen等［25］在大腸桿菌K系列菌株中敲除了脂酰輔酶A合成酶的基因 （fad D和fad E基因），并過(guò)量表達(dá)大腸桿菌硫酯酶，篩選得到高產(chǎn)突變株，其脂肪酸產(chǎn)量達(dá)到1．2g／L。

1．4 其他誘變方法育種

磁場(chǎng)生物學(xué)效應(yīng)是生物磁學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)。磁場(chǎng)作用于生物體的最直接效應(yīng)可能是影響膜內(nèi)電場(chǎng)變化、細(xì)胞膜及跨膜信息傳遞活性、細(xì)胞酶活、自由基基團(tuán)等，進(jìn)而引起生物大分子 （如DNA）造成損傷，使生物產(chǎn)生基因的損傷和突變等效應(yīng)，從而間接影響基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)［26］。盡管電磁場(chǎng)對(duì)微生物基因表達(dá)的作用機(jī)制目前尚不清楚，但國(guó)內(nèi)外已有大量關(guān)于磁場(chǎng)作用于微生物菌株的研究。高夢(mèng)祥等［27］利用磁場(chǎng)處理啤酒酵母，發(fā)現(xiàn)磁場(chǎng)強(qiáng)度0．563A／m和0．669A／m作用時(shí)間2h時(shí)，磁場(chǎng)對(duì)啤酒酵母促進(jìn)作用最強(qiáng)，其菌液濃度增長(zhǎng)了34．01%。磁場(chǎng)處理猴頭菌，發(fā)現(xiàn)磁場(chǎng)強(qiáng)度為0．8A／m，作用時(shí)間為24h時(shí)，胞外多糖的生長(zhǎng)促進(jìn)作用最強(qiáng)，猴頭菌胞外多糖質(zhì)量濃度增長(zhǎng)率達(dá)187．5%［28］。Ozden等［29］研究極低頻磁場(chǎng)對(duì)粘紅酵母產(chǎn)轉(zhuǎn)化酶產(chǎn)量的影響，結(jié)果表明，7m T磁場(chǎng)處理組的生物量較對(duì)照組增加了14%～28%，處理組較對(duì)照組轉(zhuǎn)化酶產(chǎn)量增加了48%～67%?；诖艌?chǎng)對(duì)微生物菌株生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)量的促進(jìn)作用，使得磁場(chǎng)可以作為微生物菌種誘變研究中的有效手段。在微生物育種中也用到其他誘變技術(shù)，如空間、激光、微波等誘變方法。

2 篩選方法

篩選得到目標(biāo)微生物菌種是微生物育種的最終目的。通過(guò)各種誘變手段改變菌體的遺傳性狀后，如何從數(shù)量龐大的菌體族群中篩選特異性目標(biāo)菌種，是育種上最關(guān)鍵也最耗時(shí)費(fèi)力的工作，篩選在一定程度上是決定菌種選育效率的關(guān)鍵步驟［16］。

2．1 抗性篩選法

微生物的某些抗生素抗性突變會(huì)直接影響其產(chǎn)物的代謝調(diào)控系統(tǒng)［30－31］，從而改變突變株代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，因此抗性篩選法可用于有用產(chǎn)物生產(chǎn)菌優(yōu)良菌株的選育和改良?？股乜剐院Y選是基于微生物對(duì)抗生素產(chǎn)生耐藥性發(fā)展起來(lái)的菌株選育技術(shù)，因其實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)便、效果顯著而在有用微生物菌株選育中得到廣泛應(yīng)用［32］。而篩選方法一般包括單一抗性篩選如鏈霉素抗性篩選，多種抗生素的多重抗性篩選，以及與其他誘變技術(shù)相結(jié)合的抗性篩選。

張智翔等［33］以玫瑰孢鏈霉菌 （Streptomyces roseosporus）ATCC 11379為出發(fā)菌株，通過(guò)在不同濃度梯度的達(dá)托霉素和鏈霉素復(fù)合抗性平板上進(jìn)行抗性篩選，結(jié)果篩選到一株高產(chǎn)達(dá)托霉素的突變株D1000－S3－2，經(jīng)搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證達(dá)托霉素發(fā)酵單位可達(dá)59mg／L，比出發(fā)菌株提高了63．8%。劉垚等［34］以經(jīng)紫外線誘變處理過(guò)的博來(lái)霉素產(chǎn)生菌為對(duì)象，應(yīng)用鏈霉素抗性篩選法獲得了151株鏈霉素抗性突變株，并獲得一株產(chǎn)抗生素能力為出發(fā)菌株約1．25倍的突變株。阿維菌素高產(chǎn)菌株Y0910－67的篩選就是以Y0909－12為原始菌株，經(jīng)過(guò)亞硝基胍誘變后，采用鏈霉素進(jìn)行抗性篩選得到的，其效價(jià)較對(duì)照高出16．9%［35］。

2．2 熒光篩選法

熒光標(biāo)記技術(shù)是一種非放射性的標(biāo)記技術(shù)，是指利用一些能發(fā)熒光的物質(zhì)共價(jià)結(jié)合或物理吸附在所要研究分子的某個(gè)基團(tuán)上，利用它的熒光特性來(lái)提供被研究對(duì)象的信息［36］。近年來(lái)，熒光標(biāo)記技術(shù)取得了迅速的發(fā)展，廣泛應(yīng)用于原生質(zhì)體融合子的篩選、微生物菌株篩選、細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)檢測(cè)等方面，在微生物學(xué)研究領(lǐng)域里發(fā)揮了很大的作用。

熒光染色標(biāo)記是一種非人工遺傳標(biāo)記，其可用于標(biāo)記原生質(zhì)體來(lái)篩選融合子菌株。在制備原生質(zhì)體時(shí)，使雙親株原生質(zhì)體帶上不同的熒光色素，原生質(zhì)體融合后，直接篩選出帶有兩色熒光的融合子即可。龍建友等［37］在鏈霉素No．24菌株及其誘變株Ms－24菌株的原生質(zhì)體懸浮液中分別加入酚藏花紅和伊文思藍(lán)2種熒光色素進(jìn)行標(biāo)記，將帶有紅、藍(lán)熒光色素的親本原生質(zhì)體融合，然后在熒光顯微鏡下直接篩選同時(shí)帶有紅藍(lán)熒光的融合子。利用熒光染料進(jìn)行標(biāo)記分析，操作簡(jiǎn)便、高穩(wěn)定性、高靈敏度、高選擇性，而且還可以大大縮短融合的工序和時(shí)間，提高篩選融合子的效率，是一種快捷、高效的的篩選方法，現(xiàn)已被眾多研究者廣泛使用。

熒光素酶是生物組織體內(nèi)由于代謝活動(dòng)催化熒光素或脂肪醛氧化發(fā)光的一類(lèi)酶的總稱，其可用于標(biāo)記基因、細(xì)胞和活體動(dòng)物。標(biāo)記方法是通過(guò)分子生物學(xué)克隆技術(shù)，將熒光素酶基因插到預(yù)期分析的細(xì)胞染色體內(nèi)，通過(guò)單克隆細(xì)胞技術(shù)的篩選，培養(yǎng)出能穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的細(xì)胞株［38］。Vesterlund等［39］利用細(xì)菌的熒光素酶基因克隆到金黃色葡萄球菌，大腸桿菌和沙門(mén)氏菌等指示菌中，使得指示菌具有熒光酶基因lux AB和負(fù)責(zé)合成長(zhǎng)鏈脂肪醛的luxCDE基因，用于產(chǎn)生熒光，可以快速檢測(cè)并篩選出具有抗菌作用的菌株，且該方法已經(jīng)用于快速篩選具有抗菌活性的乳酸菌［40］。該方法具有快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，可以在1～2h內(nèi)得到結(jié)果，是一種快捷、高效的的篩選方法。

2．3 基于PCR的快速篩選法

PCR即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （Polymerase Chain Reaction，PCR），是美國(guó)PE－Cetus公司的科學(xué)家Kary Banks Mulis于1985年發(fā)明的一種可在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列，并在短時(shí)間內(nèi)可獲得大量特異DNA序列拷貝的新技術(shù)。由于PCR技術(shù)可快速特異地?cái)U(kuò)增任何期望的DNA片段或目的基因且操作簡(jiǎn)便、特異性和靈敏度高、結(jié)果可靠，所以其自1985年問(wèn)世以來(lái)至今得到了迅速發(fā)展，該技術(shù)已廣泛用于微生物學(xué)、分子生物學(xué)、生物工程和生物分類(lèi)學(xué)等領(lǐng)域中。隨著現(xiàn)代分子生物技術(shù)、基因組測(cè)序和生物信息學(xué)等的快速發(fā)展與廣泛應(yīng)用，使得基于PCR方法的快速篩選可以作為微生物菌種篩選研究中的有效手段，可以快速篩選出所需的目標(biāo)菌種。

隨著不同乳酸菌菌株基因組測(cè)序的完成及乳酸菌代謝產(chǎn)物編碼基因等生物信息的豐富，Michat等［41］根據(jù)已知的class IIa型細(xì)菌素的編碼基因，設(shè)計(jì)了編碼class IIa細(xì)菌素基因的7對(duì)保守的PCR引物，利用PCR方法從40種奶酪樣品中篩選出了產(chǎn)class IIa細(xì)菌素的乳酸菌。張紅發(fā)等［42］在基因序列數(shù)據(jù)庫(kù)中查找益生雙歧桿菌的16Sr DNA共有序列，找出它們共有的特異性序列，設(shè)計(jì)了PCR引物，平板培養(yǎng)分離，初步篩選雙歧桿菌菌落。根據(jù)細(xì)菌16Sr DNA和23S r DNA兩側(cè)高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)通用引物，提取菌落基因組DNA，擴(kuò)增16S－23Sr DNA間區(qū)序列，并送測(cè)序。通過(guò)3輪PCR及序列同源性比對(duì)分析鑒定，從人體定向篩選到長(zhǎng)雙歧桿菌。傳統(tǒng)篩種方法具有隨機(jī)性、盲目性，而PCR篩菌增加了目的性和效率，給篩菌工作帶來(lái)了很大的便利。

雖然PCR技術(shù)的篩選方法具有靈敏、快速、簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，但是在實(shí)際操作過(guò)程中所利用的特異性引物的特異性上很難把控，需要在其特異性靶點(diǎn)上下功夫，才能保證較高的擴(kuò)增產(chǎn)物濃度。

3 結(jié)語(yǔ)

微生物育種中的誘變和篩選環(huán)節(jié)極為繁雜，尤其是篩選工作量很大，尋找快速、有效的高通量篩選平臺(tái)至關(guān)重要。在微生物菌種選育生產(chǎn)實(shí)踐中可根據(jù)不同菌種的特點(diǎn)及生產(chǎn)需求，選擇不同的誘變技術(shù)和篩選方法。隨著遺傳學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域的飛速發(fā)展，基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)及生物信息學(xué)的應(yīng)用日益廣泛，相信許多新型高效的技術(shù)將被應(yīng)用于菌種誘變篩選，創(chuàng)造出更多有利于發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)的微生物新品種，大大推動(dòng)工業(yè)微生物菌種改良篩選技術(shù)的發(fā)展，為微生物工業(yè)帶來(lái)新的希望。

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