王定鋒，王慶森，吳光遠(yuǎn)

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，福建 福安 355015）

茶尺蠖（Ectropis obliquaProut）隸屬鱗翅目（Lepidoptera）尺蛾科（Geometridae），又名茶尺蛾，俗稱拱拱蟲、量寸蟲、吊絲蟲，分布于我國各主要產(chǎn)茶區(qū)，年發(fā)生代數(shù)多（約6代），產(chǎn)卵量大，常在局部茶園暴發(fā)成災(zāi)，是我國茶樹的主要害蟲之一。主要以幼蟲取食嫩葉和成葉，發(fā)生嚴(yán)重時(shí)可將茶樹食成禿枝，對茶葉產(chǎn)量、品質(zhì)和茶樹樹勢影響較大，對夏、秋茶為害最重。除危害茶樹外，還可危害大豆、豇豆、芝麻、向日葵等[1-3]。盡管農(nóng)業(yè)防治和物理防治在茶尺蠖的防治中有采用[4-6]，但更多的還是使用農(nóng)藥防治，特別是化學(xué)農(nóng)藥[6-7]?；瘜W(xué)農(nóng)藥的長期大量使用，造成茶葉農(nóng)藥殘留超標(biāo)、害蟲產(chǎn)生抗藥性和環(huán)境污染等問題，正日益受到人們的重視。昆蟲病原微生物具有對靶標(biāo)害蟲專一、不傷害天敵和環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，是害蟲綜合治理（Integrated Pest Management，IPM）的重要組成部分。本文就病毒的研究與應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述，為更好地發(fā)掘、開發(fā)和利用這類病原因子提供參考。

1 茶尺蠖核型多角體病毒

隸屬于桿狀病毒科（Baculoviridae）A亞組的茶尺蠖核型多角體病毒（Ectropis obliqueNuclear Polyhedrosis Virus,EoNPV）對茶尺蠖幼蟲具有較高的致病力，可長期存在于茶園生態(tài)系統(tǒng)中，是該系統(tǒng)中制約茶尺蠖自然種群發(fā)展的重要病原微生物[8]。

1.1 EoNPV生物學(xué)特性

1977年趙燁烽等[9]在我國首次發(fā)現(xiàn)茶尺蠖病毒病的流行，并初步推斷致病因素是一種核型多角體病毒，而后朱國凱等[10]經(jīng)過鑒定進(jìn)一步確認(rèn)該病毒為核型多角體病毒。毛迎新[11]等應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)明確了EoNPV湖北分離株是不同于安徽分離株的一個(gè)新的地區(qū)分離株。長期以來，國內(nèi)研究人員對EoNPV的形態(tài)學(xué)[12-13]、血清型[14]、毒性[8,15]和安全性[8,16-17]等生物學(xué)特性以及EoNPV對茶尺蠖幼蟲取食、生長發(fā)育的影響[18-19]及田間種群的控制[20]做了大量的研究，為進(jìn)一步開展病毒的檢測、劑型的開發(fā)以及田間施用情況奠定了基礎(chǔ)。葉恭銀[21]等開展了3種主要環(huán)境因子（溫度、紫外線和茶園露水）對茶尺蠖核型多角體病毒毒力的影響，結(jié)果表明適于病毒感染各齡幼蟲的溫度范圍是 18～26℃；紫外線對離體病毒的影響與溫度及病毒濃度有關(guān)；而茶園露水對離體病毒無明顯影響。殷坤山[22]等試驗(yàn)表明茶尺蠖核型多角體病毒對高溫和紫外較敏感，但對pH適應(yīng)范圍較寬。

1.2 EoNPV的擴(kuò)繁

病毒的大量擴(kuò)繁是實(shí)現(xiàn)病毒制劑規(guī)模化生產(chǎn)和田間大面積示范推廣的先決條件，但病毒的擴(kuò)繁卻受環(huán)境溫度[23-25]、飼毒濃度、寄主齡期[23]和寄主規(guī)?；曫B(yǎng)程度等條件的制約。吳曉晶[23]等研究表明，飼毒濃度是影響EoNPV產(chǎn)量的最主要因子，其次是飼毒時(shí)寄主幼蟲的蟲齡，在25℃，光暗比為9﹕15（h）時(shí)病毒產(chǎn)量最高；葉恭銀、胡萃[24-25]研究表明，26℃適于茶尺蠖核型多角體病毒（EoNPV）的增殖和病毒形態(tài)的正常發(fā)生。唐美君[26]研究表明在24℃下條件下用5×l05PIB/ml病毒液浸漬的葉片喂養(yǎng)茶尺蠖3齡中期幼蟲，病毒的產(chǎn)量最高，可達(dá)6.02×108PIB/頭。在明確病毒增殖影響因素的基礎(chǔ)上，室內(nèi)大規(guī)模飼養(yǎng)茶尺蠖以便進(jìn)行活體繁殖病毒是當(dāng)前面臨的最大難題之一。不少研究者對茶尺蠖人工飼料配方及室內(nèi)飼養(yǎng)條件進(jìn)行了一系列的研究[27-31]，從蟲源選擇、飼料配方篩選和飼養(yǎng)條件入手，初步解決了茶尺蠖在冬季與早春因飼料不足導(dǎo)致繼代飼養(yǎng)困難的難題，為提供相同蟲齡的試臉材料以及增殖病毒的蟲源，打下基礎(chǔ)。盡管如此，茶尺蠖室內(nèi)大規(guī)模飼養(yǎng)仍然面臨規(guī)模較小而不能滿足大量病毒增殖的問題。郭睿[32]等則通過基因工程技術(shù)構(gòu)建了感染茶尺蠖后可以擴(kuò)增的重組家蠶核型多角體病毒（rBmNPV）為利用家蠶作為宿主來生產(chǎn)重組病毒殺蟲劑奠定了基礎(chǔ)。

1.3 EoNPV制劑的研發(fā)與應(yīng)用

我國研究者通過一系列室內(nèi)試驗(yàn)和田間實(shí)踐，不斷改進(jìn)、完善EoNPV制劑。殷坤山等詳細(xì)介紹了適合基層茶場實(shí)際操作的茶尺蠖核型多角體病毒土法生產(chǎn)技術(shù)[33]；并在研究茶尺蠖病毒殺蟲劑田間使用技術(shù)后，提出要抓住茶尺蠖第1、2代和第5、6代的1～2齡幼蟲期[34]。洪北邊等篩選出具有一定抗紫外能力的茶尺蠖核型多角體病毒制劑EoNPV2H2和EoNPV2H4[35]，并開展了2種制劑的室內(nèi)和田間防治試驗(yàn)，均取得了較好的效果[35-36]。葉恭銀等研究發(fā)現(xiàn)EoNPV病死蟲勻漿稀釋液抗紫外線能力最強(qiáng)，而加莧菜紅食品染料的提純病毒次之，在此基礎(chǔ)上篩選出適于高溫季節(jié)的茶尺蠖核型多角體病毒制劑EoNPV-Ⅰ乳劑，對茶尺蠖3齡初幼蟲殺蟲活性達(dá) 89.04%[37]。胡萃等從健蟲飼養(yǎng)、病毒增殖、病毒提取和病毒貯存四個(gè)方面詳細(xì)介紹了茶尺蠖核型多角體病毒的生產(chǎn)工藝流程[38]。為了適應(yīng)生產(chǎn)與市場需求，陳華才等研制了3種EoNPV制劑（EoNPV 乳劑、EoNPV-Bt乳劑、EoNPV-溴氰可濕性粉劑），并證實(shí)這3種制劑在室內(nèi)和田間對茶尺蠖的防治效果均在90%以上，此外，還進(jìn)行了大面積的示范應(yīng)用，取得了較高的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)效益[39]。為明確不同地理種群的茶尺蠖對EoNPV的敏感性存在較大差異的現(xiàn)象，席羽等對不同地理區(qū)域的茶尺蠖種群，進(jìn)行了病毒毒效和毒力的生物測定，明確了茶尺蠖不同地理種群對EoNPV病毒的敏感性存在顯著差異，這為后續(xù)開展其機(jī)理研究及應(yīng)對策略提供基礎(chǔ)[40]。

在EoNPV制劑使用過程中，研究者還開展了EoNPV與農(nóng)藥混配的研究，以便提高殺蟲效果。葉恭銀等研究表明殺滅菊酯和硫酸銅對EoNPV具有一定的增效作用[37]。商建農(nóng)等研究發(fā)現(xiàn)EoNPV與敵滅靈、哇硫磷混用無增效作用[41]。徐健等的研究表明，Bt與EoNPV混配具有增效作用，并研制發(fā)出茶尺蠖病毒 Bt制劑尺蠖清（1.0×107 PIB/mLEoNPV + 2000 IU/mg Bt），大面積應(yīng)用對茶尺蠖防效可達(dá)92.4%，對茶園其它鱗翅目害蟲（茶毒蛾、刺蛾和茶銀尺蠖等）兼治效果達(dá)60%以上，保葉率達(dá)92.1%，而且對茶園天敵沒有殺傷作用[42-43]。殷向東等則研究了Bt與EoNPV混配的理想配比，為配比的最佳性判別建立了較為系統(tǒng)而可靠的基礎(chǔ)，具有很好的應(yīng)用價(jià)值[44-45]。

1.4 EoNPV定性、定量檢測技術(shù)的建立

隨著茶尺蠖病毒在茶園中的大面積推廣應(yīng)用，研究該病毒的感染和復(fù)制機(jī)制及在自然界的流行規(guī)律，建立快速、穩(wěn)定、靈敏度高、特異性強(qiáng)而又安全的檢測方法至關(guān)重要。張永安等建立了基于茶尺蠖EoNPV多角體蛋白基因的PCR檢測技術(shù)，可以靈敏的檢測茶尺蠖子代卵和蛹中EoNPV的存在[46]。杜軍利等初步建立了茶尺蠖核型多角體病毒熒光定量 PCR檢測方法[47]，隨后袁志軍等對該檢測方法進(jìn)行了優(yōu)化，使該方法能定性定量檢測茶尺蠖核型多角體病毒類生物農(nóng)藥以及監(jiān)測病毒對茶尺蠖的感染過程[48]。杜軍利等還制備能特異地與EoNPV病毒粒子蛋白結(jié)合的EoNPV的單克隆抗體，并建立了基于此單抗的ELISA檢測方法，從而提供了更為準(zhǔn)確快速的EoNPV檢測技術(shù)[49]。而譚榮榮等利用提純的茶尺蠖核型多角體病毒蛋白，制備其特異性多克隆抗體，建立Indirect-ELISA檢測方法，為進(jìn)一步研究該病毒的血清學(xué)特性及建立高通量、快速的病毒檢測技術(shù)奠定基礎(chǔ)[50]。

1.5 重組NPV病毒的研究

隨著對EoNPV分子生物學(xué)研究的深入，以及全基因組測序工作的完成，為利用基因工程技術(shù)改造菌株奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)[51-52]。為提高殺蟲速率，擴(kuò)大殺蟲譜，林晨構(gòu)建了包含茶尺蠖幾丁質(zhì)合成酶（Chitin synthase，CS）CS1保守基因雙鏈干涉序列的重組 NPV病毒，并證明了重組病毒殺蟲效率明顯高于野生型出發(fā)菌株（尤其對低齡幼蟲），而且對蠶和石榴尺蠖也具有一定的殺蟲活性[53]。為了解決茶尺蠖飼養(yǎng)復(fù)雜而導(dǎo)致茶尺蠖核型多角體病毒（EoNPV）繁殖困難，郭睿等通過基因工程技術(shù)拓展了家蠶核型多角體病毒（rBmNPV），使經(jīng)家蠶擴(kuò)增后的 rBmNPV重組菌株能夠感染茶尺蠖并在茶尺蠖體內(nèi)擴(kuò)增，該研究為利用家蠶作為宿主來生產(chǎn)重組病毒殺蟲劑奠定了基礎(chǔ)[32]。

2 茶尺蠖小RNA病毒

王小純等報(bào)道從茶尺蠖蟲尸上分離純化到一株新的非包涵體病毒，茶尺蠖小RNA病毒（Ectropis obliquapicorna-like virus）[54-55]，并對該病毒基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析[56-57]。林美娟等構(gòu)建了茶尺蠖小RNA病毒全長 cDNA克隆，為從分子水平研究EoPV病毒生物學(xué)特性、病毒復(fù)制機(jī)理等奠定了基礎(chǔ)[58]。Cheng等研究揭示了茶尺蠖小RNA病毒的2C蛋白R(shí)NA螺旋不穩(wěn)定和鏈退火加速活性，這可能是茶尺蠖小 RNA病毒復(fù)制和發(fā)病機(jī)理的關(guān)鍵，這些結(jié)果對我們理解小RNA病毒和病毒RNA分子伴侶有重要意義[59]。此外，武漢大學(xué)還以茶尺蠖核型多角體病毒和茶尺蠖小 RNA病毒為主體構(gòu)建了茶尺蠖雙病毒復(fù)合殺蟲劑，充分兼容了2種病毒的殺蟲優(yōu)勢，具有一定的應(yīng)用前景。

3 討論

茶尺蠖核型多角體病毒是一種高效、安全的生物農(nóng)藥，但由于其利用害蟲活體擴(kuò)繁的特點(diǎn)，目前其生產(chǎn)規(guī)模仍然受限于茶尺蠖室內(nèi)規(guī)?；曫B(yǎng)階段。雖然前期已經(jīng)開展了大量茶尺蠖室內(nèi)飼養(yǎng)的研究[23-31]和利用基因工程技術(shù)構(gòu)建以家蠶作為宿主進(jìn)行擴(kuò)繁的重組病毒[32]，但在實(shí)際操作中還未能真正解決茶尺蠖大量飼養(yǎng)的難題。因此，今后有必要從蟲源的選擇、人工飼料配方和室內(nèi)飼養(yǎng)條件的優(yōu)化等幾個(gè)方面進(jìn)一步研究茶尺蠖大量飼養(yǎng)的問題，以便滿足EoNPV商業(yè)化生產(chǎn)的需要。此外，茶尺蠖小RNA病毒雖然在分子生物學(xué)方面開展了大量的工作[56-59]，但在病毒擴(kuò)繁、劑型開發(fā)及田間施用方面的研究還鮮有報(bào)道，今后可開展相關(guān)的研究，以便更好地應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐。與化學(xué)殺蟲劑相比，茶尺蠖病毒存在殺蟲速度慢、殺蟲譜窄、受環(huán)境因子影響較大等弊端。在篩選出高毒力病毒毒株的基礎(chǔ)上，除了優(yōu)化劑型配制外，利用基因工程技術(shù)來改良病毒毒株，可以獲得殺蟲毒力更強(qiáng)和殺蟲譜更寬的重組毒株[53]，通過改變宿主范圍來解決大量擴(kuò)繁問題的重組毒株[32]以及具有更好環(huán)境適應(yīng)性的重組毒株。雖然利用基因工程技術(shù)改良的病毒毒株可以更好地滿足生產(chǎn)上的需要，但目前還缺乏關(guān)于重組病毒毒株對環(huán)境的安全性評估的相關(guān)報(bào)道，這也是今后有待深入研究的內(nèi)容。

前人已經(jīng)開展了大量EoNPV與其它農(nóng)藥混用的試驗(yàn)[37,41-45]，針對茶尺蠖的防治藥劑也在不斷更新，所以有必要適時(shí)開展新型防治藥劑與EoNPV混用的試驗(yàn)，以滿足生產(chǎn)上的實(shí)際需求。

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