許 剛，趙晨光(蘭州軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院全軍骨科中心，烏魯木齊 830000;通訊作者，E-mail:zcgxinjiang@126.com)

臀肌攣縮癥(gluteal muscle contracture，GMC)是一種多發(fā)于兒童，由多種原因引起的臀部肌肉及其筋膜的纖維變性，繼發(fā)髖關(guān)節(jié)內(nèi)收、內(nèi)旋功能障礙，表現(xiàn)特有步態(tài)的臨床綜合征。臀肌攣縮癥基本病理變化是間質(zhì)增生及纖維化，其發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，注射因素、免疫因素及遺傳因素等可能參與了發(fā)病過程［1-4］。轉(zhuǎn)化生長因子-β3(transforming growth factor- β3，TGF-β3)是一種具有多種生物學(xué)作用的細(xì)胞因子，參與調(diào)控細(xì)胞增殖與分化、機(jī)體的生長和發(fā)育、組織修復(fù)、腫瘤發(fā)生等生理病理過程［5，6］，最近研究發(fā)現(xiàn) TGF-β3與組織纖維化密切相關(guān)［7-9］。為了進(jìn)一步討論TGF-β3在臀肌攣縮癥中的作用，本實(shí)驗(yàn)檢測TGF-β3在臀肌攣縮癥患者臀肌攣縮帶中的表達(dá)水平，并初步探討TGF-β3在攣縮帶形成過程中的作用。

圖1 攣縮帶及攣縮帶旁臀大肌組織中TGF-β3的表達(dá) (免疫組化，×400)Figure 1 Expression of TGF-β3in the fibrotic muscle and the adjacent muscle by immunohistochemistry (×400)

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2011-10～2013-05在我院住院實(shí)施臀肌攣縮癥松解術(shù)的23例臀肌攣縮癥患者，其中男性10例，女性13例，年齡7-27歲，平均18.6歲?；颊咴谶M(jìn)行手術(shù)時(shí)進(jìn)行取材，取材包括攣縮帶及攣縮帶旁正常臀大肌組織，每份組織分為兩部分，一部分組織用生理鹽水沖洗后立即置于凍存管中在液氮中保存，另一部分組織進(jìn)行甲醛固定，制作切片后備用。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑及儀器 TRIzol液購自美國Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自立陶宛Fermentas公司，SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ購自大連寶生物工程有限公司，TGF-β3單抗購自美國 Santa Cruz公司，SAP試劑盒購自美國Vector公司，PCR引物由北京奧科公司合成，熒光定量PCR擴(kuò)增儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2.2 實(shí)時(shí)定量PCR檢測TGF-β3mRNA的表達(dá)水平 從液氮中取出標(biāo)本，研磨后加入1.0 ml TRIzol液提取細(xì)胞總RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。參照Genbank cDNA中的 TGF-β3及內(nèi)參β-actin基因序列設(shè)計(jì)引物，TGF-β3上游引物5’-AAGCGGCGTTT-GGCAATATC-3’，下游引物5’-GACGAAGAAGCGGACTGTGT-3’，產(chǎn)物大小212 bp;β-actin上游引物5’-GCCGCCAGCTCACCAT-3’，下游引物 5’-TGCCCACCATCACGCCC-3’，產(chǎn) 物 大 小 153 bp。PCR反應(yīng)體系包括:10.0 μl SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ(2 ×)、上、下游引物(10 μmol/L)各 2.0 μl、6.0 μl DNA模板。反應(yīng)條件:95℃ 10 s預(yù)變性，95℃ 5 s、61℃ 30 s 40個(gè)循環(huán)。基因的相對(duì)表達(dá)采用2-ΔΔCt分析。其中實(shí)驗(yàn)組ΔCt=目的基因Ct-內(nèi)參基因Ct，對(duì)照組ΔCt=目的基因Ct-內(nèi)參基因Ct，ΔΔCt=實(shí)驗(yàn)組ΔCt-對(duì)照組ΔCt。

1.2.3 免疫組化檢測TGF-β3的表達(dá) 將4 μm厚度的石蠟切片在60℃烘箱中烘烤30 min，二甲苯脫蠟后進(jìn)行下行梯度酒精中脫苯、水化。切片浸泡于檸檬酸抗原液中進(jìn)行抗原修復(fù)，滴加3%H2O2去離子水阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，然后滴加封閉血清，封閉非特異性抗體。滴加小鼠抗人TGF-β3單克隆抗體(1∶200)，孵育盒中密封，4℃過夜后SAP染色試劑盒常規(guī)顯色，顯微鏡下觀察結(jié)果并照相，以PBS代替一抗作為空白對(duì)照。結(jié)果判定:以低倍鏡和高倍鏡分別觀察切片，陽性染色為細(xì)胞間質(zhì)有紅色條索狀物質(zhì)著色，染色明顯高于背景，根據(jù)染色深淺分級(jí)［10］:①陽性面積百分率:無顯色記為0分，1%-25%記為1分，26%-50%記為2分，51%-75%記為3分，大于76%記為4分。②染色強(qiáng)度:未著色記為0分，淺紅色記為1分，紅色記為2分，深紅色記為3分。③綜合評(píng)分:兩項(xiàng)相加0-1分為(-)，2-3分(+)，4-5分為(++)，6-7 分為(+++)。本實(shí)驗(yàn)最終計(jì)數(shù)采用雙盲法分別由兩位病理醫(yī)師計(jì)數(shù)，差異超過10%重新計(jì)數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 TGF-β3mRNA表達(dá)水平結(jié)果

實(shí)時(shí)定量PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)TGF-β3mRNA在攣縮帶中的表達(dá)水平(1.76±0.63)明顯高于攣縮帶旁臀大肌組織的表達(dá)水平(1.28±0.49)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 TGF-β3的免疫組化結(jié)果

攣縮帶中TGF-β3彌漫性分布于成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中(圖1，見第1007頁)，其中2例為(+)，16例為(++)，5 例為(+++)，而在攣縮帶旁臀大肌組織中TGF-β3表達(dá)量非常少，其中4例為(-)，18例為(+)，1例為(++)。

3 討論

臀肌攣縮癥由Valderrama在1970年首次報(bào)道，常發(fā)生于兒童，如不及時(shí)治療可影響患兒的生長發(fā)育。臀肌攣縮癥的發(fā)病是一個(gè)復(fù)雜的過程，共同的基本病理變化是間質(zhì)增生及纖維化。其發(fā)病原因尚未完全清楚，普遍認(rèn)為與兒童反復(fù)肌肉注射有關(guān)，此外免疫調(diào)節(jié)等因素也參與了發(fā)病［1-4］。

TGF-β是一種具有多種生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子，參與多種生理病理過程，與病理性瘢痕形成、組織器官纖維化有密切聯(lián)系［11-14］。TGF-β共有5種亞型或異構(gòu)體，其中 TGF-β1，TGF-β2，TGF-β3存在哺乳動(dòng)物中，其中TGF-β1可以作用于成纖維細(xì)胞，促進(jìn)其合成大量的Ⅰ、Ⅲ、型膠原蛋白、彈性蛋白、整合素、蛋白多糖等多種細(xì)胞外基質(zhì)成分，從而促進(jìn)創(chuàng)傷愈合及瘢痕形成，是一種重要的致纖維化因子［13，14］。人 TGF-β3的基因定位于染色體 14q24，與TGF-β1有77%的氨基酸同源性，研究證實(shí) TGF-β3通過與TGF-β1競爭轉(zhuǎn)化生長因子βⅡ型受體(TβRⅡ)可以拮抗TGF-β1的作用，可以減輕瘢痕形成和纖維化［6，14］。我們前期研究發(fā)現(xiàn) TGF-β1在臀肌攣縮帶中的表達(dá)增加，可能參與了臀肌攣縮癥的發(fā)生發(fā)展過程［15］。為了研究TGF-β3在臀肌攣縮癥中的作用，我們利用免疫組化檢測了臀肌攣縮帶中TGF-β3的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)攣縮帶中TGF-β3彌漫性分布于成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中，呈強(qiáng)陽性，而在攣縮帶旁的臀大肌組織中TGF-β3表達(dá)量非常少。同時(shí)我們利用實(shí)時(shí)定量PCR在 mRNA水平上證實(shí)TGF-β3在攣縮帶中的表達(dá)水平明顯高于自身周圍臀大肌的表達(dá)水平。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果及我們前期研究結(jié)果［15］，提示臀肌攣縮癥患者臀肌攣縮帶中TGF-β1、TGF-β3上調(diào)可能與臀肌纖維化有關(guān)，TGF-β1的致纖維化作用與TGF-β3的抗纖維化作用之間的動(dòng)態(tài)平衡參與了肌肉纖維化發(fā)生發(fā)展過程。

綜上所述，TGF-β3在臀肌攣縮癥患者的臀肌攣縮帶中高表達(dá)，TGF-β3可能參與了臀肌攣縮癥的臀肌纖維化過程。進(jìn)一步研究TGF-β3在臀肌攣縮癥不同發(fā)病階段的作用可能為揭示臀肌攣縮癥具體發(fā)病機(jī)制及生物學(xué)治療提供理論依據(jù)。

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